综述：液体活检在胃肠道肿瘤中的应用：ctDNA、CTCs和sEVs的临床转化与整合

《Oncology Reviews》：Liquid biopsy in gastrointestinal oncology: clinical applications and translational integration of ctDNA, CTCs, and sEVs

本综述系统阐述了液体活检（Liquid Biopsy）技术，包括循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）和小细胞外囊泡（sEVs）在胃肠道（GI）癌症早期检测、微小残留病（MRD）监测及个体化治疗中的前沿进展与临床转化路线图，为精准肿瘤学实践提供了重要指引。

　　

1 引言

癌症是全球第二大致命疾病，早期检测至关重要。虽然组织活检仍是诊断的金标准，但其具有侵入性，且常无法捕捉肿瘤的异质性或随时间的变化。液体活检通过分析血液、唾液、尿液或其他体液中的肿瘤源性物质，提供了一种非侵入性、实时且更全面的肿瘤生物学和进展图谱。这种创新的诊断方法最大限度地减少了患者的不适，并能够实时监测肿瘤演变和治疗反应。此外，组织活检可能不适用于早期肿瘤的检测。在通常诊断较晚且治疗选择有限的胃肠道（GI）癌症中，液体活检为疾病管理提供了更精确的方法。关键生物标志物包括循环肿瘤细胞（CTCs）、细胞外囊泡（EVs）和循环肿瘤DNA（ctDNA）。CTCs是从原发或转移部位脱落到血流中的癌细胞，其检测通常依赖于上皮标志物（如EpCAM、细胞角蛋白）或大小和密度差异。CTCs的单细胞测序进展为了解遗传异质性和耐药机制提供了宝贵见解。EVs是由大多数细胞类型分泌并存在于生物体液中的多种膜结合囊泡群体。小EVs（sEVs，<200 nm），其中包括外泌体，因其在生理和病理过程中的作用而被广泛研究。它们通过转移生物活性分子在细胞间通讯中发挥关键作用，并越来越多地因其在疾病发病机制、诊断和治疗中的作用而被研究。在液体活检中，sEVs因其能够携带蛋白质、脂质、核酸（DNA、mRNA、非编码RNA）和代谢物而日益突出。这些分子货物反映了其来源细胞的生理和病理状态，使得sEVs成为有价值的生物标志物。它们在早期癌症检测、预后评估和治疗监测方面具有巨大潜力，为了解肿瘤生物学和辅助个性化肿瘤策略提供了见解。在GI肿瘤发生中，sEVs通过重塑微环境、增强血管生成和调节免疫反应来促进癌症进展，支持转移。它们在体液中的非侵入性检测使得能够监测疾病进展、治疗反应和复发。基于sEVs的检测提高了GI癌症的诊断准确性、患者分层和临床决策。同样，ctDNA是液体活检方法的重要组成部分，由癌细胞通过凋亡、坏死或主动分泌释放到血流中的短核酸片段组成。ctDNA反映了其肿瘤的遗传和表观遗传景观，使得GI癌症的非侵入性液体活检成为可能。它支持早期检测、进展监测、微小残留病（MRD）、复发和治疗反应监测。在结直肠癌、胃癌和胰腺癌中，ctDNA可检测突变、耐药性和复发风险，指导个性化治疗。本综述旨在审视液体活检技术的进展，并批判性评估其在每种常见GI癌症类型中的显著临床潜力。它探讨了这些技术的最新发展，并评估了它们对GI癌症临床管理的影响。

2 技术格局与预分析考量

脆弱的循环生物标志物需要超灵敏的工作流程，结合下一代测序与错误抑制条形码、数字PCR和微滴数字PCR，每种都与特定构建的富集模式配对。CTCs预富集、sEVs的微流体捕获和定量ctDNA检测现在提高了MRD检测、系列治疗监测和即时、数据驱动的治疗调整的能力。全血必须抽取到稳定管中，及时运输并在冷链控制下处理，以保护生物分子完整性免受偏差加速降解的影响。预分析差异（收集管、离心速度、存储时间）和异质性测序或PCR平台导致了显著的实验室间变异性，使荟萃分析和可重复标准化工作复杂化。富集利用了物理和生物学差异：尺寸排阻过滤器去除较小的血细胞，而免疫隔离通过EpCAM或其他表面标志物捕获肿瘤细胞。尖端微流控芯片在纳米级通道内整合了尺寸选择和抗原特异性陷阱，实现了CTCs回收的高灵敏度和纯度，同时为液体活检和更广泛的临床诊断应用设定了性能基准。先进的富集平台增强了液体活检的诊断能力。CTC-iChip将尺寸过滤与磁性免疫捕获相结合，实现无标记CTCs回收。介电泳通过介电特性分离CTCs，无需标记即可捕获上皮和间充质表型。光声流式细胞术通过光学吸收特征实时检测和分离稀有CTCs。对于sEVs分离，基于密度的超速离心、尺寸排阻过滤和基于抗体的免疫捕获仍然是标准方法，而声学纳米过滤器最近作为高效高通量方法出现，可在富集过程中保持囊泡完整性。功能化有抗CD63/CD81纳米结构的微流控芯片提高了捕获特异性，ExoChip平台将分离和分析整合在一个步骤中，切向流过滤能够连续、高纯度地收获sEVs。统一的液体活检方法始于生物体液收集和样品制备，随后是CTCs、sEVs和ctDNA的并行或顺序处理。每个生物标志物类别需要特定的预分析和分析工作流程，从磁珠捕获到微流体富集和核酸测序。整合了分离、检测和定量步骤的集成平台对于提高标准化、减少操作者变异性和实现常规临床使用至关重要。一系列技术创新革命性地改变了循环生物标志物的分析和分离，提高了灵敏度、特异性和操作效率。功能化有二氧化硅或序列特异性配体的磁珠简化了工作流程，提高了回收率，并缩短了处理时间。纳米孔测序提供了ctDNA的实时、单分子 interrogation，以卓越的灵敏度检测稀有变异。微滴微流体平台封装单个片段，对其进行扩增和测序，实现了碱基水平突变和甲基化分析。微流体和声学纳米过滤器进一步增强了捕获特异性；无标记系统现在可以回收上皮和间充质CTCs表型，克服了免疫亲和盲点。而其他方法整合了切向流过滤和更新的磁珠设备，巩固了步骤，减少了劳动力并降低了成本，这对资源有限的实验室是有利的。此外，高通量微滴检测和纳米孔读取器也促进了治疗反应和MRD的连续跟踪，直接为临床决策提供信息。自动化、微流体隔离器巩固了常规应用的可重复性和标准化。

3 按肿瘤类型划分的临床应用

3.1 食管癌

液体活检是管理食管癌（EC）的有前途的非侵入性工具，减少了在监测和治疗指导中对重复组织活检的依赖。在接受帕博利珠单抗和新辅助放化疗治疗的胃食管结合部（GEJ）腺癌中，系列ctDNA分析有效跟踪治疗反应和疾病进展；治疗后ctDNA清除与更高的病理完全反应和更好的结局相关，而持续存在则指示复发风险。除了数量，ctDNA分析，包括TP53突变和甲基化，可能有助于早期诊断。在晚期HER2阳性GE腺癌的CAPOX-BETR方案研究中，ctDNA检测到的EGFR、FGFR1、MET和KRAS扩增与临床结局相关，支持其在个性化治疗中的应用。最近的数据也支持ctDNA在微小残留病检测和早期复发预测中的作用。正在进行的试验如EXPLORING II期随机试验正在评估ctDNA指导的治疗强化在ctDNA阳性胃癌和GEJ癌症中使用XELOX、安罗替尼和penpulimab。与健康个体相比，EC患者细胞游离DNA（cfDNA）水平升高并携带肿瘤特异性变化，支持其在监测中的作用。在一项随机对照试验中，食管鳞状细胞癌术前化疗后CTC计数减少与改善的预后相关，突出了它们在治疗评估中的效用。此外，富含tRNA-GlyGCC-5的唾液sEVs可以区分恶性和良性状况，结合实时测序可能增强早期诊断和监测。

3.2 胃癌

胃癌（GC）由于诊断晚和预后差，仍然是一个重大挑战。液体活检已经改变了非侵入性诊断和治疗监测。在一项前瞻性临床研究中，腹膜灌洗CTCs和ctDNA可以预测晚期GI癌症患者术后异时性腹膜转移，而另一项研究证实了液体活检在指导HER2阳性转移性GC治疗中的效用。一项前瞻性研究验证了其用于早期GC诊断，并且多基因组液体活检标志物在神经内分泌肿瘤中优于传统标志物如CgA，表明在GC中的相关性。更高的围手术期ctDNA水平与更差的结局相关，使用CAPOX-贝伐珠单抗-曲妥珠单抗的II期试验证实了ctDNA在精准肿瘤学中的效用。两项独立的随机III期国际试验提供了支持液体活检标志物可行性的证据。在GEJ肿瘤中，手术前/后检测不到的ctDNA预测了优越的生存期并与T细胞扩增相关，突出了其免疫学作用。在一项I期研究中，ctDNA证实了FGFR2/3改变并反映了对FGFR抑制剂KIN-3248的反应。此外，冯·维勒布兰德因子 bearing sEVs被确定为诊断和治疗靶点，含有PD-L1的sEVs与切除后不良结局相关，作为独立的预后指标。另一项研究表明，外泌体miR-29b抑制腹膜转移，支持基于sEVs的治疗，而外泌体miR-92a-3p也被指出作为非侵入性早期诊断生物标志物，BM-MSC来源的外泌体过表达miRNA-1228通过抑制SCAI促进GC进展。提供新的治疗途径，来自TAMs的巨噬细胞来源的sEVs被证明促进血管生成、转移和耐药。CTCs分析提高了诊断准确性，并支持晚期GC的实时治疗决策。使用CTCs跟踪HER2阳性GC中曲妥珠单抗的耐药性；总体而言，液体活检支持GC的早期检测、治疗调整和非侵入性监测，其价值在HER2靶向治疗中得到加强。ctDNA、CTC和sEVs在新辅助、不可切除或转移性GC中辅助治疗指导。

3.3 胆管癌

胆管癌（CCA）是一种罕见且侵袭性的胆管癌，受益于液体活检的进展，它通过ctDNA分析提供了肿瘤特异性改变的微创检测，这在获取组织活检困难的情况下尤为重要。ctDNA能够识别可操作突变如FGFR2融合和IDH1/2突变以指导靶向治疗。一项FGFR抑制剂KIN-3248的I期临床试验证明了ctDNA的效用，在63.3%的病例中确认了FGFR2/3改变，并将ctDNA清除与影像学反应相关联，支持其在患者选择和实时治疗监测中的作用。CTCs研究揭示了非传统CTCs（ncCTCs），缺乏上皮标志物，扩展了检测能力并改善了对肿瘤异质性和进展的见解。sEVs进一步推进了诊断和监测策略，血清和尿液来源的miR-21和miR-221谱反映了肿瘤RNA特征，而sEVs携带的FGFR2 mRNA支持早期检测。一项前瞻性观察性研究确定了一个特定的外泌体PIWI-interacting RNA（piRNA）特征，包括piR-10506469、piR-20548188和piR-01856912，作为CCA早期检测和个性化护理的新型诊断生物标志物。总之，ctDNA、CTCs和sEVs巩固了液体活检作为CCA早期诊断、监测和精准肿瘤学的关键工具。

3.4 结直肠癌

结直肠癌（CRC）在高HDI国家发病率和死亡率分别排名第三和第二。转移在15%–30%的病例中是同步的，并在20%–50%的局部病例中后期发展。癌变涉及APC或TP53丢失、RAS/BRAF/PIK3CA激活或微卫星不稳定性。EGFR、VEGFR和HER2信号传导驱动进展；HER2在5%的转移瘤中扩增，通常伴有RAS突变（17%）。ESMO建议在抗EGFR或抗VEGFR治疗前进行生物标志物分析，但通路突变常导致耐药。ctDNA实现了实时突变检测、耐药监测和疾病跟踪，解决了组织活检的局限性。术后ctDNA预测残留疾病和复发；阳性状态支持辅助治疗，而阴性可能证明省略是合理的。高基线MAF或治疗中VAF预测较差的生存期，系列ctDNA跟踪微卫星稳定CRC中的突变负荷和免疫变化。RAS野生型ctDNA指示抗EGFR获益，RAS突变信号耐药。几项随机II期试验评估了RAS、BRAF或EGFR突变的清除，并支持单克隆抗体再挑战。这些发现随后完善了辅助治疗决策。在EVICT和NEW BEACON研究中，ctDNA被用于指导BRAF V600E和KRAS G12C突变的治疗。类似地，ctDNA中的HER2（ERBB2）水平告知抗HER2治疗决策并监测治疗反应。ctDNA中GRIA4、RARB、VIM、WNT5A、SDC2、SLC8A1和NPY的甲基化与不良预后相关，并可能有助于早期检测。同样，基于cfDNA的筛查模型如GALNT9/UPF3A显示出高灵敏度和特异性。同时，MethyDT测试（NTMT1/MAP3K14-AS1）在CRC诊断中优于SEPT9，提供了更好的依从性，尽管需要进一步验证。来自ctDNA的基于血液的MSI负荷预测免疫治疗反应，尽管区分肿瘤和免疫DNA仍然具有挑战性。CTCs与CRC中的转移、侵袭性和预后相关，基于FOLFOXIRI和贝伐珠单抗 versus FOLFOX，识别患者进行强化治疗，并评估手术或支架结局，而腹膜灌洗检测预测不良结局。间充质CTCs信号复发和高死亡率。CTCs还与MRD中的免疫功能障碍和较差的生存期相关，可能是由于MMP-2介导的免疫抑制，尽管一些研究报告附加价值有限。EVs提供了替代生物标志物；肿瘤来源的EVs促进进展，内皮EVs预测转移性CRC的生存期。CRC血浆EVs重编程单核细胞并因疾病阶段而异。sEVs相关miRNAs，如miR-19b、miR-21、miR-222和miR-92a有助于早期诊断，高miR-222水平预测较差的生存期，而低sEV-miR-193a-5p与淋巴结扩散相关。外泌体circ-133随疾病阶段升高，circ-HMGCS1通过circ-HMGCS1/miR-34a-5p/SGPP1轴驱动侵袭。一项多中心研究确定了一个五miRNA粪便特征，有潜力改善非侵入性CRC筛查。

3.5 胰腺癌

胰腺癌（PC）仍然是癌症死亡的主要原因之一，生存率约为10%。晚期诊断限制了治愈选择，突出了对早期生物标志物的需求。KRAS突变ctDNA稀少且易出错；将其与血清蛋白标志物结合提高了诊断准确性。肿瘤来源的ctDNA比良性cfDNA短，尤其是在早期PC中。在PDAC中，ctDNA检测用于PARP抑制剂使用的BRCA2突变和克隆性KRAS/GNAS改变。KRAS突变ctDNA信号不良预后，而野生型状态与更好的生存期相关，尽管它不预测免疫治疗反应。KRAS G12D/V突变扩展T-reg细胞并抑制抗肿瘤免疫，尤其是G12V。升高的中性粒细胞与淋巴细胞比率与ctDNA存在相关，将炎症和肿瘤负荷联系起来。有效治疗期间系列ctDNA下降与晚期疾病改善的生存期相关。特别是，ELI-002P疫苗减少了参加AMPLIFY-201 I期试验的几名PC患者的ctDNA。术后ctDNA下降预测更长的生存期；cfDNA片段组学支持这一趋势。尽管产量有限，ctDNA在化疗后仍保留预后价值；术前ctDNA在非随机对照试验中仍反映肿瘤状态。循环肿瘤DNA的甲基化检测（HOXD8、POU4F1）通过两项临床试验的事后分析增强了转移性PC的预后。“PASEA”前瞻性观察性研究在62.4%的PDAC中检测到KRAS突变，ctDNA清除标记稳定性，再次出现信号进展。CTCs预测晚期PDAC的药物反应和生存期，跟踪治疗反应和早期转移，并可通过微流体装置在早期阶段检测到。EVs也持有诊断前景，尽管需要与良性EVs区分。一个三模块PPI模型确定了LEP和SSTR5作为具有预后价值的关键调节因子。数字ELISA测试（DEST）显示EVs中升高的MUC5AC预测IPMN进展为癌。EVs-TFs触发促血栓状态，驱动进展和化疗耐药，并独立预测死亡率。EVs中的GPC1和CD82标志物可能支持诊断。EVs RNA研究显示miR-200家族上调促进EMT和转移，具有高诊断准确性。PDAC EVs还递送miR-155-5p，激活NF-κB，抑制EHF，并驱动侵袭性。在一项多中心病例对照研究中，六个失调的外泌体miRNAs显示出诊断价值，尤其是与CA19-9结合时，尽管治疗后动态仍不清楚。一个三miRNA特征预测了较差的生存期。结合cf-miRNA和exo-miRNA产生了一个13-miRNA特征用于早期检测，即使在低CA19-9病例中。两个诊断性血浆面板包括五个miRNAs和一个三个miRNAs。CA19-9仍然是标准标志物，但蛋白质面板、炎症标志物或ctDNA增强了其诊断范围并检测非阈值病例。聚糖sTRA与CA19-9结合可能预测化疗耐药。自分泌运动因子，由CAFs分泌，介导治疗耐药和TGFβ抑制后的肿瘤生长，表明在监测治疗中有价值。NETest，一种多基因血液测试，有助于神经内分泌癌症的早期检测和监测。尽管有进展，识别用于早期PC检测和治疗反应的可靠生物标志物仍然具有挑战性。

3.6 肝癌

肝癌是全球癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌（HCC），主要由慢性HBV或HCV感染引起，占病例的75%–85%。由于早期检测差，诊断常发生在晚期。液体活检在早期诊断和监测中 gaining value。Hepa-AiQ ctDNA甲基化测试在早期HCC和复发预测中优于AFP和DCP，尽管仅限于中国患者的CHB/LC相关病例。在PETAL Ib期研究中，ctDNA有效跟踪新抗原疫苗的反应并揭示了肿瘤异质性；然而，免疫反应不足以完全根除残留疾病。在另一项II期临床试验中，ctDNA水平的变化反映了对TACE与PD-1抑制剂的影像学反应，术后增加预测了免疫抑制治疗期间的复发。在HBV相关病例中，vh-DNA跟踪肿瘤负荷和复发风险，但缺乏普遍适用性。切除后cfDNA浓度独立预测复发优于AFP。cSMART检测到的突变（TERT、TP53、CTNNB1）与AFP、AFP-L3和PIVKA-II结合，创建了一个优于单独AFP的模型，尤其是对于早期HCC。mt-HBT测试，结合cfDNA甲基化标志物、AFP和性别，显示出88%的整体和82%的早期灵敏度，优于AFP和GALAD。PreCar Score，基于cfDNA特征，在非肝硬化、HBV相关病例中增强了检测，尤其是与超声结合时。CTCs计数和间充质特征预测复发风险并告知切除策略，而前入路减少了术中CTCs扩散和早期复发。基于CTCs的模型，结合大小、结节计数和MVI，准确预测复发，手术前/后高CTCs水平指示较差的生存期和转移风险。TACE前EV大小>145.65 nm与较差的预后相关。sEVs蛋白质如A2MG和PIGR显示出比AFP更好的诊断准确性，而其他（Fetuin-A、Meprin A）在SORAMIC试验研究中指示进展。在非病毒HCC中，EV标志物（GPX3、ACTR3、ARHGAP1）预测SIRT和索拉非尼结局。EV lncRNAs如SENP3-EIF4A1、FAM72D-3、EPC1-4和一个面板（MALAT1、DLEU2、HOTTIP、SNHG1）显示出诊断和预后潜力。一个结合的EV纯化和RT-ddPCR测试在早期HCC检测中实现了高灵敏度和特异性。MYCN与肝功能和纤维化相关，在预测进展中优于AFP。一个五蛋白面板（OPN、GDF15、NSE、TRAP5、OPG）有效检测早期HCC，一个七自身抗体面板显示出比AFP更大的灵敏度。光谱学在超声失败的肥胖肝硬化患者中被证明对早期检测有用，并且血小板mRNA标志物已被提出用于早期HCC检测。

4 临床决策框架：将液体活检工具与临床目标匹配

为了将新兴证据转化为可操作的临床策略，我们提出了一个以决策为导向的框架，使每种液体活检模式（ctDNA、CTCs和EVs）与GI癌症中的特定肿瘤学目标保持一致。例如，基于EVs的分析，尤其是在唾液或血浆中，为早期检测或筛查提供了前景，特别是与miRNA特征结合时。此外，sEVs代表了液体活检中独特的生物标志物类别，提供了超越遗传突变的复杂肿瘤生物学的分子货物。与主要反映肿瘤特异性遗传改变的ctDNA和提供完整循环肿瘤细胞表型和基因组信息的CTCs不同，EVs携带一组多样的生物活性分子，包括miRNAs、蛋白质、脂质和代谢物。这种货物影响肿瘤进展、免疫逃避和转移龛形成，从而提供了对肿瘤微环境相互作用和系统性疾病过程的见解。例如，特定的EV来源的miRNAs如miR-21、miR-29b和miR-92a-3p已与胃肠道癌症中的肿瘤生长、化疗耐药和预后相关联，而EVs携带的PD-L1等蛋白质与免疫检查点调节和治疗反应相关。这些分子特征提供了独特的临床优势，尤其是在ctDNA水平低或CTC捕获具有挑战性的情况下，例如在早期疾病或某些上GI癌症中。此外，sEVs在体液中高度稳定，使其适合重复采样和纵向监测。新兴证据也支持它们在预测治疗结局和免疫反应中的作用，从而补充了从ctDNA和CTCs分析中获得的信息，并丰富了个性化肿瘤学策略。相反，通过系列血浆采样的ctDNA分析是MRD检测、治疗反应监测和分子复发预测最稳健的工具。另一方面，CTCs计数和表型分析可能特别有助于预测转移扩散、免疫逃避和药物耐药，尤其是在结直肠癌和胰腺癌等癌症中。生物标志物的选择也受肿瘤位置和疾病程度的影响。在上GI恶性肿瘤（食管癌、胃癌、胆管癌）中，由于解剖学采样限制，CTCs和sEVs通常产生更高的诊断效用。在下GI癌症（结直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌）中，ctDNA往往更丰富且在临床上有可操作性，尤其是在转移情况下。最后，晚期疾病或接受积极全身治疗的患者可能最受益于实时ctDNA跟踪，而药物耐药可以通过结合ctDNA突变分析和动态CTCs分析来进一步评估。

5 从实验室到临床：GI肿瘤学中液体活检的临床整合路线图

液体活检在GI癌症中持有强大前景，但其临床转化仍然不完整。为了从实验效用转向标准护理，需要一个结构化的路线图——一个使检测开发、监管验证和临床采用保持一致的模式。我们提出了一个五阶段整合模型来指导液体活检平台在GI恶性肿瘤中的系统实施。该框架强调技术 harmonization、通过临床终点验证以及肿瘤学家、病理学家和实验室人员之间的跨学科合作。

5.1 第一阶段：分析和临床前验证

液体活检临床转化的第一步是开发用于ctDNA、CTCs和EVs的高保真、可重复检测。此阶段的关键要求是实施标准化工作流程，能够减少实验室间变异性并确保临床可比性。我们提出了一个GI特异性分析工作流程，旨在解决GI肿瘤的独特挑战。

5.2 第二阶段：临床验证

此阶段侧重于证明液体活检指标与有意义的临床终点之间的相关性。

5.3 第三阶段：实施和培训

为了临床整合，必须发生三个并行举措。

5.4 第四阶段：AI和多组学整合

随着数据集复杂性增加，人工智能和机器学习将至关重要。

5.5 第五阶段：监测和适应性管理

最后阶段将液体活检定位为精准监测的基石。

6 局限性与未来方向

液体活检研究的近期进展是有希望的；然而，显著的局限性继续制约着GI肿瘤学中证据的稳健性和普遍性。许多研究涉及小型和异质性患者队列，这限制了统计效力并阻碍了有意义的亚组分析，特别是对于胆管癌等较少见的恶性肿瘤，其中数据仍然 notably sparse。方法学变异性仍然是一个关键障碍。预分析程序的差异——包括血液收集管、离心方案和存储条件——结合分析平台的不一致性，如测序技术、PCR检测和富集方法，导致了显著的实验室间变异性。这种标准化的缺乏阻碍了为生物标志物如ctDNA等位基因频率、CTCs计数和EVs signature建立临床相关阈值。此外，现有研究的地理和机构集中性限制了外部有效性，因为许多证据来源于单中心调查或来自东亚和选定欧洲机构的队列。这些局限性引起了关于发现在不同人群和医疗系统中更广泛适用性的担忧。此外，当前许多数据是描述性或探索性的。尽管回顾性分析和早期前瞻性试验提供了有价值的 proof-of-concept 见解，但证明总生存期、无进展生存期或成本效益改善的大型、随机、多中心研究仍然稀缺。生物学复杂性也对临床转化构成了实质性挑战。瘤内异质性、克隆进化和生物标志物脱落的变异性导致了假阴性和不一致的结果，而在早期疾病中当生物标志物丰度低时，区分肿瘤来源信号与背景循环物质仍然特别困难。展望未来，该领域必须优先考虑 harmonized 协议、广泛的国际合作以及人工智能驱动分析框架的 incorporation。只有通过 rigorous 设计、全球代表性的临床试验，液体活检才能从实验性辅助工具转变为常规肿瘤学护理中经过验证、标准化的组成部分。在技术和临床进步的同时解决经济因素、监管异质性、实验室间变异性和教育需求对于确保液体活检有效融入日常临床实践至关重要。

7 结论

液体活检在GI恶性肿瘤中提供了敏感、微创的组织采样补充。其组成部分CTCs、ctDNA和EVs捕捉瘤内异质性，支持早期检测并实现实时治疗监测。在EC和GC中，将ctDNA与CTCs计数结合 refined 新辅助决策，而早期耐药检测允许快速治疗调整。富含蛋白质或miRNA的sEVs sharpened 预后并可能预测免疫治疗获益。CCA提出了独特的诊断和治疗挑战，通常由于获取足够组织样本困难。在这种情况下，针对FGFR和IDH等基因中可操作改变的ctDNA分析不仅绕过了组织活检的局限性，还为靶向治疗的选择提供了信息。ctDNA的纵向监测可以指导治疗过程中剂量或治疗药物的修改，支持更适应性和响应性的疾病管理方法。CRC一直处于液体活检采用的前沿，术后ctDNA检测作为MRD的高度敏感指标。ctDNA突变谱的动态变化可以预示即将发生的复发，而新发RAS野生型状态可能重新开放抗EGFR治疗的资格，从而扩大治疗选择。此外，sEVs货物分析已被证明为转移性疾病提供了额外的风险分层，特别是在常规标志物不确定的情况下。在PC中，液体活检的诊断灵敏度通过将ctDNA分析与血清蛋白标志物整合或采用片段组学方法检测亚临床疾病而增强。KRAS相关调节性T细胞富集和化疗耐药相关循环肿瘤 initiating 细胞的识别为指导免疫学和药理学干预提供了宝贵见解。外泌体miRNAs——miR-200家族、miR-155-5p——增强了诊断和预后面板。HCC研究显示ctDNA甲基化检测和病毒-宿主DNA杂交体增强了早期检测，而将ctDNA