基于IVIM与DKI的多功能MRI模型预测乳腺癌HIF-1α、Ki-67及VEGF表达状态的研究

《Frontiers in Oncology》：A multifunctional MRI model based on IVIM and DKI predicts HIF-1α, Ki-67, and VEGF status in breast carcinoma

本研究创新性地将体素内不相干运动（IVIM）与扩散峰度成像（DKI）相结合，构建多参数MRI模型，旨在无创预测乳腺癌关键生物标志物缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、增殖指数Ki-67及血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。结果表明，联合模型（AUCs: 0.852-0.923）相较于单一参数能更精准地评估肿瘤异质性，为乳腺癌的个性化治疗决策提供了强有力的影像学工具，具有显著的临床转化潜力。

　　

引言

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一，且近年来在年轻人群中的发病率呈上升趋势。从分子角度来看，乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，这为精准评估和实施个性化临床治疗带来了巨大挑战。肿瘤内部的缺氧、新生血管形成和细胞增殖等因素共同导致了这种异质性，并在很大程度上影响了乳腺癌的治疗反应、预后和复发风险。生物标志物如缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、Ki-67和血管内皮生长因子（VEGF）被公认为肿瘤内异质性的指示剂，分别反映了肿瘤对缺氧的适应性反应、增殖活性和血管生成潜能。虽然活检是诊断的金标准，但其侵入性及有限的取样范围限制了其全面捕捉肿瘤空间异质性的能力。因此，迫切需要能够全面表征肿瘤微环境的非侵入性成像技术。

在个性化医疗时代，乳腺成像已成为乳腺癌诊断、分期、治疗和监测的重要组成部分。磁共振成像（MRI）因其无电离辐射、软组织分辨率高、多序列成像能力以及可重复性好等优点，在肿瘤疾病评估中极具价值。随着肿瘤诊疗体系的逐步完善，肿瘤成像的定量评估近年来变得愈发重要。扩散加权成像（DWI）的表观扩散系数（ADC）可以反映水分子的随机运动（布朗运动）。然而，由于血液微循环和肿瘤变异性的影响，ADC值可能无法准确代表组织内水分子的真实运动。应用双指数扩散衰减模型的体素内不相干运动（IVIM）技术，可以在不使用造影剂的情况下展示与组织扩散和灌注相关的水分子参数，从而弥补了传统DWI的局限性。此外，扩散峰度成像（DKI）能有效解释组织微观结构的复杂性，提供扩散率和峰度数据，从而获得更精确的扩散信息。因此，基于扩散加权成像的多功能磁共振成像能够更准确地反映肿瘤的异质性。

尽管DWI、IVIM和DKI已越来越多地应用于非小细胞肺癌、肝细胞癌、子宫内膜癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤的分子标记物预测，但很少有研究系统性地评估和比较这些技术（无论是单独使用还是组合使用）在预测乳腺癌HIF-1α、Ki-67和VEGF表达方面的诊断性能。此外，整合模型的潜力尚未得到充分探索。因此，本研究旨在定量评估和比较DWI、IVIM、DKI以及组合模型在预测这些生物标志物表达水平方面的价值。

材料与方法

研究对象与临床因素

本研究回顾性纳入了2021年1月至2023年12月期间经病理证实的126例乳腺癌患者。纳入标准包括：a) 所有受试者均接受了常规MRI、IVIM和DKI检查；b) 无MRI检查禁忌症；c) 拥有完整的临床病理资料。排除标准为：a) 在MRI检查前接受过任何预处理，包括核心针活检、放疗、化疗或手术；b) MRI图像质量差（定义为存在严重运动伪影或信噪比不足以可靠放置感兴趣区域）或检查日期不完整；c) MRI后一周内未行肿瘤切除术；d) 肿瘤非肿块型。最终，104例符合标准的患者被纳入研究。此外，根据相同的纳入和排除标准，从另一家三级医疗中心同时招募了91例乳腺癌患者，组成外部验证队列，以评估模型的普适性。

MRI技术

采用GE Discovery 750W 3.0T MR扫描仪，使用专用的8通道相控阵线圈，所有患者取俯卧位，双乳置于线圈内。MRI序列包括DKI、快速自旋回波T1加权成像（FSE-T1WI）、脂肪抑制快速恢复快速自旋回波T2加权成像（FRFSE-T2WI）、DWI和IVIM。FSE-T1WI图像的采集参数为：回波时间（TE）=10 ms，重复时间（TR）=420 ms，激励次数（NEX）=1，矩阵=320×288。FRFSE-T2WI图像的参数为：TR=6000 ms，TE=88 ms，NEX=2，矩阵=320×288。DWI参数为：NEX=2，TR=3600 ms，矩阵=320×288，TE=73 ms，b值=0和1000 s/mm²。IVIM参数定义为：TE=90 ms，13个b值（0, 20, 30, 50, 70, 100, 150, 200, 500, 700, 1000, 1500, 2000 s/mm²），矩阵=128×128，NEX从1增加到6，TR=2500 ms。DKI采集序列为：NEX=2，矩阵=128×128，b值=0, 1000, 2000 s/mm²，TE=90 ms，视野（FOV）=35 cm×35 cm，TR=5000 ms，层厚=4 mm，层间距=0.4 mm。以上序列层厚均为4mm，FOV=35 cm×35 cm，层间距=0.4 mm。

MRI评估

利用Function tool MADC和DKI软件（GE Healthcare, USA）处理生成的DWI、IVIM和DKI数据，以获取参数图。

对于DWI，使用单指数模型生成ADC图：S_b/S₀ = exp (-b·ADC)，其中b为扩散因子，具体为b=0 s/mm²和b=1000 s/mm²。

采用先前报道的拟合方程计算IVIM衍生参数：S_b/S₀ = (1 - f) × exp (-b × D) + f × exp[-b × (D* + D)]。其中，S_b代表具有扩散加权b值的MRI信号强度，S₀代表非扩散加权信号的强度。D表示与纯扩散相关的水分子真实扩散系数。伪扩散系数D*对应于与灌注相关的非相干微循环，灌注分数f表示微血管体积分数。

DKI衍生参数使用以下方程获得：S_b = S₀·exp(-b²·D² + b·D²·K/6)。其中，S_b和S₀分别对应不同b值（0 s/mm²和其他值）下的信号强度。平均扩散系数（MD）表示校正了非高斯效应后的正常条件下的扩散系数，而平均峰度（MK）表示非高斯扩散行为。

由两位对病理结果和临床数据不知情的放射科医生（ZW，5年经验；WW，8年乳腺MRI经验）独立绘制感兴趣区域（ROI）。由于IVIM和DKI图像信噪比较低，根据轴位DWI和T2WI图像（b=1000 s/mm²）选择肿瘤最大层面来确定ROI。在肿瘤实性部分（尽可能避开囊变、出血和坏死区域）绘制三个面积为50~150 mm²的ROI，然后将其复制到D、D*、f、MD和MK的伪彩图上。计算两位放射科医生定量参数的平均值进行最终分析。若ROI放置存在显著差异（定义为任何参数测量值差异>10%），则共同重新审阅图像以达成共识。这种方法侧重于实性成分，旨在最大限度地减少坏死和出血对参数计算的干扰，尽管可能无法完全捕捉整个肿瘤的异质性。

病理学评估

所有参与患者均接受了手术治疗，具体为根治性乳房切除术（68例）、改良根治性乳房切除术（24例）和保乳手术（12例）。从临床数据库中提取了多种病理特征，如组织学类型、肿瘤大小、ER/PR/HER-2/HIF-1α/VEGF/Ki-67状态、组织学分级、肿瘤亚型和患者年龄。所有HIF-1α、Ki-67和VEGF的免疫组织化学评估均在术后切除的肿瘤肿块标本上进行。由两位独立的病理医生（工作经验分别为6年和15年）根据雌激素受体（ER）、Ki-67、人表皮生长因子受体-2（Her-2）和孕激素受体（PR）的水平进行评估。当10%或以上的细胞核呈现阳性染色时，判定PR和ER为阳性。Ki-67表达≥14%视为阳性，低于此阈值则为阴性。Her-2染色强度半定量评分为：0分（阴性），1+（弱），2+（中度），3+（强）。0或1+分意味着Her-2阴性，而3+分被归类为Her-2阳性。对于评分为2+的肿瘤，进行荧光原位杂交以进一步评估基因扩增。确定了四种不同的乳腺癌分子亚型：Her-2阳性型（ER和PR阴性，Her-2阳性）、管腔A型（Her-2阴性，ER或PR阳性，Ki-67≥14%）、三阴性型（ER、PR和Her-2均为阴性）和管腔B型（Her-2阴性，ER或PR阳性，Ki-67<14%）。通过计算HIF-1α阳性细胞数与总细胞数的比率来评估HIF-1α，评分如下：0分（0–25%），1分（25–50%），2分（50–75%），3分（75–100%），4分（100%）。染色强度评级为：0分（无色），1分（浅黄色），2分（棕色），3分（深棕色）。染色强度<2分且HIF-1α阳性细胞<2分定义为低表达，否则为高表达。VEGF免疫染色的评分系统基于计算的阳性细胞百分比（0，无阳性细胞；1，≤25%阳性细胞；2，25%<阳性细胞≤50%；3，>50%阳性细胞）以及染色强度（0=阴性；1=弱；2=中度；3=强）。这些参数的分级产生综合得分0–2、3–4和5–6，分别对应阴性、阳性和强阳性结果。

统计学分析

使用MedCalc 19.5.1、R版本4.0.0和SPSS 25.0进行统计分析。统计分析在专业统计学家监督下进行。采用组内相关系数（ICC）评估观察者间的一致性。ICC≤0.20为差；0.20<><><>

结果

临床与病理学特征

研究中的104名参与者平均年龄为52.99±9.58岁，范围29至71岁。在这104例乳腺癌中，95例（91.3%）为浸润性导管癌，9例（8.7%）为非浸润性导管癌。104例患者中，11例（11%）被归类为管腔A型，19例（18%）为HER-2阳性型，51例（49%）为管腔B型，23例（22%）为三阴性型。在训练集中，HIF-1α、VEGF和Ki-67高、低表达组之间的肿瘤基因型无统计学显著差异（P值分别为0.42、0.24和0.55）。这种缺乏显著相关性的情况在外部队验证队列中一致存在，相应的P值分别为0.22、0.14和0.22。

观察者间一致性

两位放射科医生报告的ADC、D、D*、f、MD和MK的ICC值分别为0.887 [95% CI: 0.837–0.922]、0.917 [95% CI: 0.880–0.943]、0.860 [95% CI: 0.800–0.903]、0.880 [95% CI: 0.828–0.917]、0.909 [95% CI: 0.868–0.937]和0.863 [95% CI: 0.805–0.905]。这些结果反映了观察者之间具有显著的一致性。

DKI、DWI和IVIM衍生参数对HIF-1α表达的诊断效能

在训练集中，HIF-1α高表达组肿瘤的D值和MD值显著低于低表达组（p<0.05）。此外，与低表达组相比，高表达组的D、f和MK值升高（p<0.05）。D[比值比（OR）=0.001，P<0.001]、D（OR=1.805，P=0.018）、MD（OR=0.168，P=0.011）和MK（OR=2034.665，P=0.015）是HIF-1α的显著预测因素。ROC曲线分析显示，在单个参数中，D值表现出最高的预测效能（AUC=0.724）。D值≤0.88×10^-3 mm²/s应强烈提示HIF-1α高表达。结合了MD、D、MK和D*的组合模型AUC为0.860，准确度为77.9%，代表了一个适度但统计学上显著的改进（Z=2.878~3.881，所有P<0.05）。在外部队验证集中观察到相似的趋势。组合模型在外部队验证集中表现出 comparable 的性能，AUC达到0.841，与训练集无显著差异（DeLong检验，Z=0.262，P=0.794）。这表明组合模型为肿瘤缺氧提供了更可靠的非侵入性评估。

DWI、IVIM和DKI衍生参数对VEGF表达的诊断效能

在训练集中，比较分析显示，相对于低表达组，VEGF高表达组的ADC、D和MD值较低，而D*、MK和f值较高（P<0.05）。此外，D（OR=1.805，p=0.018）、f（OR=1.805，p=0.018）和MD（OR=1.805，p=0.018）是评估VEGF表达状态的独立预测因子。ROC曲线分析显示，f参数是预测VEGF表达最有力的单一指标（AUC=0.882）。f参数的AUC显著大于D和MD（Z=2.036，P=0.042；Z=2.375，P=0.018）。在临床实践中，f值≥29.82%可作为提示VEGF高表达（即活跃的肿瘤血管生成）的关键影像学生物标志物。结合了D、f和MD的组合模型AUC为0.923，准确度达87.5%，其性能优于单独使用D或MD（Z=3.357，P<0.001；Z=3.927，P<0.001）。然而，值得注意的是，组合模型的AUC并未显著优于单独使用f（Z=1.837，P=0.066）。在外部队验证集中观察到相似的趋势。组合模型的普适性得到外部队验证结果的进一步支持，其AUC consistently 高达0.918。与训练集性能相比无统计学显著差异（DeLong检验，Z=0.089，P=0.929）。这表明f参数可能在评估血管生成中扮演核心角色。

DWI、IVIM和DKI衍生参数对Ki-67表达的诊断效能

在训练集中，与Ki-67低表达组相比，高表达组的ADC、D和MD值显著降低，而D和f值升高（P<0.05）。参数D（OR=0.007，P=0.002）、D（OR=1.080，p=0.005）和MD（OR=0.120，p=0.002）成为可独立评估Ki-67表达状态的预测因子。ROC曲线分析表明MD是预测Ki-67表达最具预测性的单一参数（AUC=0.762），其效能显著高于D（Z=2.022，P=0.043）。因此，MD值≤2.21×10^-3 mm²/s强烈提示肿瘤高增殖活性。此外，D、D和MD的组合模型AUC达到0.852，准确度为77.9%，优于D、D和MD单个参数（Z=2.368~4.199，所有P<0.05）。在外部队验证集中观察到相似的趋势。然而，D参数未发现统计学显著差异。训练集和外部队验证集的AUC值经DeLong检验（Z=0.073，P=0.942）无统计学显著差异（外部队验证集AUC=0.847）。这证明了模型强大且可推广的预测性能。这一结果表明，整合扩散和灌注信息为肿瘤增殖的非侵入性评估提供了更全面的视角。

预测列线图评估DWI、IVIM和DKI衍生参数在判定HIF-1α、VEGF和Ki-67表达中的效能

基于最终的回归分析，我们将与DWI、IVIM和DKI参数对HIF-1α、VEGF和Ki-67表达的诊断效能显著相关的独立因素纳入多变量回归分析，随后开发了三个列线图。接下来，我们通过建立内部校准曲线来评估模型的性能。将列线图预测的HIF-1α、VEGF和Ki-67表达概率设为X轴，实际概率在Y轴上表示。结果显示，实线更接近理想虚线，表明列线图具有更高的预测准确性（p=0.59，0.40和0.08）。决策曲线分析（DCA）突出了预测模型优异的净临床获益。

相关性分析

HIF-1α与D、f和MK分别呈轻度正相关（r=0.292，0.267，0.276，p<0.05）。HIF-1α与D和MD分别呈轻度负相关（r=-0.375，-0.302，p<0.05）。VEGF与D和f分别呈轻度和中度正相关（r=0.390，0.644，p<0.05）。VEGF与D和MD分别呈轻度负相关（r=-0.425，-0.411，p<0.05）。Ki-67与D*和f呈轻度正相关（r=0.242，0.308，p<0.05）。Ki-67与D和MD分别呈轻度负相关（r=-0.422，-0.445，p<0.05）。

讨论

乳腺癌是一种以细胞不受控制生长为特征的多方面疾病。乳腺癌细胞的快速增殖反映在Ki-67表达升高上。本研究证明，与低表达组相比，Ki-67高表达组的ADC、D和MD值降低，这与许多早期研究的结果一致。这种现象的生物学机制根植于高度增殖的肿瘤细胞导致细胞密度显著增加。这种增加显著限制了水分子的扩散，导致偏离高斯分布。根据Meng等人的研究，使用ADC值有效预测Ki-67的高、低表达存在相当大的挑战。这种差异可能归因于ADC既显示了水分子的真实扩散，也包含了毛细血管内血液微循环引起的“假性扩散”。在本研究中，与低表达组相比，Ki-67高表达组表现出更高的D和f值，表明肿瘤组织维持着高灌注水平。然而，其他研究报道D和f值与Ki-67表达无显著相关性。我们的深入分析表明，这些差异可能与IVIM序列中选择低于100-200 s/mm2的b值策略密切相关，因为这些低b值对灌注效应敏感。Zhang等人的研究表明，少于100–200 s/mm2的b值会降低参数D和f的预测效率。本研究选择的IVIM序列设置了13个b值，其中8个低于200 s/mm²。参数D、D和MD被确定为Ki-67表达状态的独立预测因子。我们的结果进一步显示，与D和D*参数相比，MD具有最高的AUC，这可能归因于DKI能够更精确地测量水分子的扩散。此外，ROC分析表明，结合所有三个定量参数的模型优于单个参数。该模型在训练队列中表现出强大的性能，更重要的是，这种强大的预测能力在外部队验证集中成功复制。这一发现表明，整合多模型方法有望提高乳腺癌Ki-67表达状态的非侵入性预测准确性，从而为术前评估肿瘤增殖活性提供了更全面的影像学基础。

实体瘤通常表现出缺氧，这是由于肿瘤细胞的快速增殖和强烈的代谢活动引起的。HIF-1α已被确定为肿瘤细胞缺氧反应中最重要的调节元件。在这里，我们观察到，与HIF-1α低表达组相比，高表达组的D和MD值较低，而D、f和MK值较高，这与之前的结果一致。我们为这些发现提出了以下机制解释：（1）HIF-1α促进肿瘤细胞摄取葡萄糖，增强其增殖和代谢能力，导致细胞密度增加，从而限制了水分子的扩散；（2）已知HIF-1α通过调节VEGF等下游因子来刺激肿瘤血管生成，从而增加组织灌注。值得注意的是，Li等人的研究报告称HIF-1α表达与D无显著相关性。这种差异再次强调了IVIM成像技术方案，特别是低b值的设置，对研究结果可比性的重大影响。上述研究仅选择了6个低于200 s/mm²的b值。本研究的数据表明，D、D、MD和MK是能够独立评估HIF-1α表达状态的因素。D（70.2%）具有最高的预测能力。MD（71.2%）和MK（70.2%）都显示出更高的准确性，这可能是因为DKI不仅能够有效量化组织非高斯扩散特征中的水分子，还能提供更准确可靠的组织微观结构信息。此外，结合D、D、MD和MK比每个单独参数表现出更高的预测准确性。此外，成功的外部验证表明我们的模型可以作为一个可靠的工具，在不同机构间非侵入性地评估肿瘤缺氧，从而支持临床决策。因此，利用这种组合模型可以增强对HIF-1α的预测，这对评估肿瘤对放疗或靶向治疗的敏感性具有潜在意义，因为缺氧通常与治疗抵抗相关。

VEGF促进血管生成过程，是评估肿瘤血管生成的定量指标。与VEGF低表达组相比，高表达组的D*和f值升高，这与先前的研究结果一致。这种变化可以通过VEGF表达对血管生成的刺激作用来解释，从而增强了肿瘤灌注。此外，相对于低表达组，高表达组的ADC和D值较低。这一观察结果可能归因于VEGF诱导血管生成的能力，从而满足增殖增加的营养需求，增加细胞密度，并进一步限制水分子的扩散。相反，Yang等人发现不同VEGF表达水平的患者在ADC和D值上没有显著差异。造成这种差异的原因可能是VEGF表达导致管腔内质子运动速度更快以及肿瘤血管数量更多。我们的研究表明，与VEGF低表达组相比，高表达组的MD值下降，同时MK值增加，与之前的发现一致，这可能是因为VEGF加速细胞增殖和肿瘤生长，导致高肿瘤异质性和水扩散显著偏离高斯分布。D、f和MD的值是评估VEGF表达状态的独立变量。值得注意的是，f的AUC显著大于其他参数。额外的ROC分析表明，使用三个定量参数的组合模型比单个参数提供了更好的诊断性能。然而，f值和组合模型之间未观察到实质性差异，这清楚地表明f是区分VEGF表达最有前景的参数。这与临床直接相关，因为抗血管生成疗法靶向VEGF通路。IVIM衍生的f参数为评估肿瘤灌注提供了一种非侵入性方法。未来，它可用于筛选可能从抗血管生成治疗中获益的患者，或监测早期治疗反应。

我们的研究存在一些具体的局限性，需要仔细考虑。首先，研究是在有限的患者队列中进行的，这可能会给研究结果带来偏倚。其次，主要将肿瘤的实性部分确定为ROI，而非涵盖整个乳腺癌，这可能无法充分捕捉肿瘤的完全异质性。第三，我们尚未实现MRI和病理学的精确“面对面”定位。第四，我们的ROI分析仅限于肿瘤的实性部分，并且排除了非肿块型病变。这可能会引入选择偏倚并限制我们研究结果的普适性。第五，IVIM成像在乳腺癌中低于100–200 s/mm²的b值的最佳确切数量仍有待确定。未来的研究应侧重于更大的样本量，纳入全肿瘤ROI以解决异质性问题，改进MRI-病理学对应关系，并优化IVIM成像的低b值，以提高乳腺癌表征的准确性和临床适用性。最后，外部队列是从单个中心招募的，样本量有限。未来有必要进行更大规模、前瞻性队列的多中心研究，以进一步证实这些发现并促进临床转化。

总之，这项回顾性研究的结果表明，结合IVIM和DKI的多参数MRI方法在非侵入性评估乳腺癌肿瘤生物学方面具有潜力。总体而言，与IVIM衍生参数相比，MD似乎是Ki-67表达更可靠的预测指标；而与IVIM和DKI的其他功能指标相比，f参数对于区分VEGF表达最为有益；IVIM的D参数结合DKI的MD和MK增强了对HIF-1α表达的评估效能。这些具有假设生成作用的结果突显了未来研究的一个有希望的方向。在训练集中，结合了IVIM和DKI精选参数的组合模型显示出比单个参数显著更高的预测性能（AUCs：0.852-0.923）。虽然AUC的增益可能不大，但该模型的价值在于它将互补的生物学信息——水扩散、微循环灌注和结构复杂性——综合成一个更全面的评估。此外，我们模型的成功外部验证不仅证明了其卓越的普适性，也证明了其对抗过拟合的稳健性。通过应用更广泛的b值，特别是低于100–200 s/mm2的b值，可以显著提高D和f测量的稳定性和准确性。此外，我们的结果表明，利用大量低于100–200 s/mm2的b值可以提高D和f参数的诊断效率。