海拔梯度对金露梅灌丛草地土壤细菌群落与胞外酶活性的影响及其驱动机制

《Frontiers in Plant Science》：Changes of soil bacterial community composition and functional groups in different altitude gradients of Potentilla fruticosa shrub in eastern Qinghai-Tibet Plateau

本研究通过分析青藏高原东部黄河源区金露梅灌丛草地不同海拔梯度下土壤细菌群落结构、多样性与胞外酶活性的变化规律，揭示了海拔变化通过调控土壤理化性质（如总碳TC、总氮TN）、微生物生物量（如微生物生物量碳MBC、氮MBN、磷MBP）以及碳（如β-葡萄糖苷酶BG）、氮（如亮氨酸氨基肽酶LAP）、磷（如碱性磷酸酶ALP）循环相关胞外酶活性，进而影响细菌群落组成（如酸杆菌门Acidobacteriota、疣微菌门Verrucomicrobiota为优势菌门）和功能群（如纤维素分解、硝化作用）的关键驱动机制。研究强调了TC、BD、CBH、AG、BG是影响细菌群落的主要环境因子，而AG、TN、BG、MBC、MBN显著影响细菌功能群，为高寒灌丛生态系统的保护与恢复提供了重要理论依据。

　　

材料与方法

研究区域位于青海省果洛藏族自治州，地处青藏高原腹地、黄河源区，平均海拔超过4200米，年均气温-0.4°C～3.7°C，年降水量400-760毫米，植被类型为高寒草甸，土壤主要为高寒灌丛草甸土。常见草本植物有莎草科、禾本科等。本研究在海拔3400米至4300米范围内，以300米为海拔跨度，选择了4个实验点（3400米、3700米、4000米、4300米）。在每个海拔梯度上设立6个10米×10米的灌丛样方，采用五点采样法采集0-20厘米深度的土壤样品，混合后形成复合样品，共获得24份土壤样品。样品一部分用于测定土壤理化性质，另一部分保存于-80°C用于高通量测序。

土壤总碳（TC）和总氮（TN）采用碳氮分析仪测定；总磷（TP）采用钼锑抗比色法测定；pH值采用水土比1:5测定；土壤含水量（SM）通过105°C烘干法测定；土壤容重（BD）采用环刀法测定。土壤微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）采用氯仿熏蒸-K₂SO₄浸提法测定，微生物生物量磷（MBP）采用氯仿熏蒸-NaHCO₃浸提法测定。

选取了土壤碳、氮、磷循环中的6种关键胞外酶进行活性测定：β-葡萄糖苷酶（BG）、纤维二糖水解酶（CBH）和α-葡萄糖苷酶（AG）为碳获取酶；β-1,4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）和亮氨酸氨基肽酶（LAP）为氮获取酶；碱性磷酸酶（ALP）为磷获取酶。酶活性采用微孔板荧光法测定。

土壤细菌群落分析采用Illumina MiSeq技术对细菌16S rRNA基因的V4区进行扩增测序。使用UPARSE软件以97%的相似度对有效序列进行操作分类单元（OTU）聚类，并利用RDP Classifier对OTU代表序列进行物种分类学注释。采用FAPROTAX数据库对土壤细菌群落进行功能预测。

统计分析采用单因素方差分析比较不同海拔梯度间的差异，利用主坐标分析（PCoA）和冗余分析（RDA）探讨细菌群落结构与环境因子的关系，通过线性判别分析（LEfSe）识别差异显著的微生物类群，并构建共现网络分析微生物间的相互作用。

不同海拔梯度下的土壤性质、微生物生物量及酶活性

海拔对土壤总碳、总氮、土壤容重、微生物生物量碳、氮、磷均有显著影响。土壤总碳和总氮随海拔升高先增加后降低，均在3700米处显著高于其他海拔。土壤容重随海拔升高先增后降再增，在3400米处含量最高。微生物生物量碳、氮、磷随海拔梯度呈现先增后降再增的趋势，三者含量均在3700米处达到峰值（MBP: 21.50 ± 4.91 mg/kg；MBC: 2334.49 ± 268.49 mg/kg；MBN: 162.16 ± 29.19 mg/kg），在4000米处显著下降，在4300米处又呈增加趋势。

海拔显著影响与土壤碳、氮、磷循环相关的酶活性。与土壤磷循环相关的碱性磷酸酶（ALP）活性随海拔升高先增后降，在3700米处最高。与土壤碳循环相关的β-葡萄糖苷酶（BG）和α-葡萄糖苷酶（AG）活性随海拔升高而降低，而β-纤维二糖苷酶（CBH）活性先增后降。与土壤氮循环相关的L-亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性随海拔升高而降低，在4300米处最低；β-1,4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）活性先增后降，在4000米处最高。

不同海拔梯度下细菌群落的α多样性

细菌α多样性在不同海拔梯度间存在显著差异。随着海拔升高，香农指数（Shannon index）先增后降，在4300米处达到峰值（9.52）。辛普森指数（Simpson index）和皮卢指数（Pielou index）随海拔升高先降后增，均在4300米处达到峰值，分别为0.99和0.76。覆盖度指数（good_coverage index）在不同海拔间无显著差异。

不同海拔梯度下细菌群落的组成与结构

在门水平上，不同海拔梯度下土壤细菌的优势类群主要为酸杆菌门（Acidobacteriota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、变形菌门（Proteobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetota），其平均相对丰度分别为25.69%、19.24%、12.36%和6.85%。不同菌门水平的相对丰度随海拔梯度变化显著。酸杆菌门相对丰度随海拔升高先增后降，在4000米处最大（30.27%）；疣微菌门相对丰度随海拔升高呈下降趋势，在4000米处最低（16.77%）；变形菌门相对丰度先增后降，在4000米处最高（13.57%）；浮霉菌门相对丰度随海拔升高而增加，在4300米处最高（7.49%）。

Venn图分析显示不同海拔梯度间共有35个细菌门，不同海拔梯度下细菌OTU总数为8144个。UPGMA聚类和主坐标分析（PCoA）表明，不同海拔梯度的细菌群落能较好区分，3700米、4000米和4300米的群落结构相似，而3400米的群落结构与其他海拔差异明显。ANOSIM和Adonis分析证实不同海拔梯度间细菌群落存在显著差异。

不同海拔梯度下细菌群落的指示微生物类群

LEfSe分析表明海拔显著改变了细菌群落。在门、纲、属水平上，一些细菌类群在不同海拔梯度下显著富集。共鉴定出LDA得分>2.0的指示细菌48种，其中3400米22种，3700米9种，4000米5种，4300米12种。大多数细菌类群主要集中在3400米海拔。在门水平上，泉古菌门（Crenarchaeota）、微小菌门（Patescibacteria）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）是3400米海拔的指示菌；疣微菌门（Verrucomicrobiota）和甲基孢囊菌门（Methylomirabilota）是3700米海拔的指示菌；酸杆菌门（Acidobacteriota）是4000米海拔的指示菌；绿弯菌门（Chloroflexi）是4300米海拔的指示菌。

不同海拔梯度下细菌功能群的变化

基于FAPROTAX数据库的功能预测获得了56个功能群。海拔梯度显著影响与碳、氮循环相关的功能群。随海拔升高，与氮循环相关的功能群，如好氧氨氧化（aerobic_ammonia_oxidation）、硝酸盐还原（nitrate_reduction）和硝化作用（nitrification）呈下降趋势；而好氧化能异养（aerobic_chemoheterotrophy）、化能异养（chemoheterotrophy）和尿素分解（ureolysis）随海拔升高明显增加。与碳循环相关的功能群，如纤维素分解（cellulolysis）、富马酸盐呼吸（fumarate_respiration）、硫酸盐呼吸（sulfate_respiration）和木聚糖分解（xylanolysis）在3400米处含量最高，甲基营养（methylotrophy）随海拔升高先降后增再降，在3700米处最低。

细菌与土壤、微生物生物量及酶活性的关系

Spearman相关分析表明优势细菌与土壤因子间存在显著关系。NAG、ALP、TC和TN与绿弯菌门（Chloroflexi）呈负相关。TC和TN与放线菌门（Actinobacteriota）和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）呈负相关。ALP、TC、TN与甲基孢囊菌门（Methylomirabilota）呈极显著正相关。AG与泉古菌门（Crenarchaeota）呈显著正相关。

Mantel检验显示，细菌α多样性与TC、TN、SM、BD和ALP呈正相关；β多样性与BD、BG、NAG、LAP、CBH和AG呈正相关。

冗余分析（RDA）表明，影响土壤细菌群落的主要驱动因子为TC、CBH、AG、BD和BG。TC箭头最长，表明TC对不同海拔梯度细菌群落整体分布影响最大，其次为CBH、AG、BD和BG。蒙特卡洛检验显示，土壤理化性质的重要性顺序为TC > CBH > AG > BD > BG > pH > SM > LAP > MBC > MBP > NAG > TP > TN > MBN > ALP。影响细菌功能群的主要因子是AG、TN、BG、MBC和MBN。

不同海拔梯度下的细菌共现网络结构

共现网络分析揭示了不同海拔梯度下细菌相互作用的差异。4300米海拔的网络节点数（191）低于3400米（195）、3700米（198）和4000米（199），但连接数高于3700米（920）和4000米（1132）。4300米海拔具有较高的平均度（avgK）和模块性（modularity），表明其网络拓扑结构更复杂，网络稳定性更高。相反，3400米网络更易受环境干扰，模块性指数为0.53。网络连接主要以正相关为主（97.26%-99.3%），表明微生物间以协同作用为主。

结论

本研究探讨了金露梅灌丛草地土壤细菌群落结构、多样性及酶活性沿海拔梯度的分布格局及驱动因素。研究发现，金露梅灌丛土壤细菌具有不同的适应性，这与土壤养分和酶活性密切相关。海拔梯度通过关联土壤性质、微生物生物量和酶活性来影响土壤细菌群落。土壤性质（TC和BD）和酶活性（CBH、AG和BG）是影响土壤细菌群落变化的主要因素，而AG、TN、BG、MBC和MBN对细菌功能群有显著影响。

研究还发现，TC、TN、SM、MBC、MBN和MBP在3700米海拔处最高，同时ALP活性最强。此外，优势菌门从3400米的酸杆菌门转变为3700米的疣微菌门。这表明该区域具有特殊的生态适应性，应优先保护，避免干扰。建议在该区域实施保护性土地利用措施（如限制过度放牧和开发），并建立金露梅灌丛植被监测体系，实时跟踪其生长及水源涵养状况。根据监测数据，及时调整保护管理措施，以维持其独特的微生物群落及生态功能，从而保障生态系统的长期稳定与可持续发展。