基于高通量测序技术探究貉肺部微生物组特征及其人畜共患病病原谱分析

《Frontiers in Microbiology》：Lung microbiota of raccoon dogs (Nyctereutes procyonoides) using high-throughput sequencing

本研究采用2bRAD微生物组测序（2bRAD-M）和病毒宏基因组学技术，首次系统解析貉（Nyctereutes procyonoides）肺炎病例的肺部微生物群落结构。研究发现以鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）为代表的49种潜在人畜共患病病原体，同时鉴定出以貉犬阿姆多细小病毒（Amdoparvovirus carnivoran3）为主导的病毒群落。该研究为貉肺炎病原复杂性认知和人畜共患病防控提供了关键科学依据。

　　

引言

貉作为基础犬科物种，其养殖业因饲喂畜禽副产品等特殊饮食习性，易引发呼吸道疾病并增加人畜共患病传播风险。中国作为全球最大貉养殖国，当前以小规模散养为主的管理模式缺乏标准化生物安全措施，导致肺炎疫情频发造成重大经济损失。本研究针对传统16S rRNA测序物种分辨率不足、全宏基因组测序（WMS）成本高昂的技术瓶颈，创新性采用2bRAD微生物组测序技术（2bRAD-M），通过IIB型限制性内切酶BcgI消化微生物基因组产生物种特异性标签，实现对低生物量肺部样本中细菌、真菌和古菌的精准物种鉴定。

材料与方法

研究团队于2019-2023年间从石家庄市10个养殖场采集30份肺炎貉肺组织样本，分别进行2bRAD-M和病毒宏基因组学分析。2bRAD-M技术通过构建包含173,165个微生物基因组的2bRAD标记数据库，采用G-score≥5的阈值控制假阳性。病毒检测方面将样本混合成3个文库，通过病毒样颗粒（VLPs）富集和去宿主序列处理，结合SPAdes组装与Kraken2分类学注释，系统解析病毒群落结构。

结果

微生物群落分析显示，在门水平以假单胞菌门（Pseudomonadota，35.67-99.77%）、子囊菌门（Ascomycota，0.07-23.17%）和放线菌门（Actinobacteria，0-24.21%）为主导。核心物种分析发现大肠杆菌（1.59-98.09%）、隐秘毕赤酵母（Pichia inconspicua，0.06-19.95%）等5个物种存在于所有样本。尤为重要的是，通过全球病原数据库（gcPathogen）鉴定出24个属的49种潜在人畜共患病病原体，其中鲍曼不动杆菌（检出率28/30，相对丰度0.59-60.45%）和肺炎克雷伯菌（检出率22/30，0.57-62.06%）呈现高流行率。

病毒组特征显示，肺组织中以Peduoviridae（50.4%）、Rountreeviridae（19.44%）和细小病毒科（Parvoviridae，10.82%）为优势病毒科。在物种水平，Valbvirus ValB1MD2（53.92%）、Andhravirus andhra（19.81%）和貉犬阿姆多细小病毒（Amdoparvovirus carnivoran3，11.19%）占总病毒组成的80%以上。研究人员成功组装出长度为4,635 bp的Amdoparvovirus近全长基因组（GenBank: PV580269），系统发育分析显示其NS1和VP2基因分别与吉林株HS-R（97.82%同源性）和冀鲁株SD-G1（98.71%同源性）高度同源。

特别值得关注的是，本研究首次在貉肺组织中鉴定出一种新型Torque Teno病毒（NPTTV）。该病毒基因组全长2,441 bp（GenBank: PV693371），包含两个开放阅读框。系统进化分析表明其ORF1基因与蜱传TTV分离株tick24_1聚为一支，未翻译区（UTR）序列相似性达83.76%，根据Anelloviridae科分类标准被认定为Theta扭矩病毒属（Thetatorquevirus）的新物种。

讨论

研究揭示的假单胞菌门和子囊菌门优势菌群，可能源于养殖环境中气溶胶微生物的吸入暴露。与犬科动物相似的微生物组成特征（以变形菌门和放线菌门为主）印证了貉的物种分类学背景。检测到的多种人畜共患病病原体，包括可引发波浪热的流产衣原体（Chlamydophila abortus）和与新生儿败血症相关的B族链球菌（Streptococcus agalactiae），突显貉作为人畜共患病储备库的公共卫生意义。

病毒组中噬菌体的优势存在，提示其与优势细菌群落可能存在协同作用。虽然检测到SARS-CoV-2（81.55%相似性）和人类疱疹病毒6型等病原的短片段，但因序列长度限制无法排除环境污染可能。貉犬阿姆多细小病毒在不同时空样本中的遗传稳定性，暗示该病毒在区域内形成稳定传播链。

研究局限性包括缺乏健康对照组样本，难以区分定植菌与真实病原体。未来需结合组织病理学和病原分离培养，进一步验证微生物的致病机制。该研究为貉养殖业疾病防控和人畜共患病预警提供了重要科学依据。