pH响应性姜黄素预处理的间充质干细胞外泌体水凝胶系统在骨科糖尿病创面愈合中的增强作用

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：pH-responsive hydrogel system loaded with curcumin-preconditioned mesenchymal stem cell exosomes for enhanced diabetic wound healing in orthopedic applications

本文开发了一种基于羧甲基壳聚糖（CMC）和四臂聚乙二醇苯甲醛（PEG-BA）通过动态希夫碱交联构建的pH响应性、可注射、自愈合水凝胶（Cur-Exo@Gel），用于在骨科相关的糖尿病慢性创面酸性微环境（pH 4.5–6.5）中控释姜黄素预处理的间充质干细胞外泌体（Cur-Exos）。该体系展现出优异的抗菌性（对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制率>50%, p < 0.05）、生物相容性，并能通过清除活性氧（ROS）、促进内皮细胞迁移和血管生成、以及通过上调Iκβ-α/抑制p65磷酸化调控巨噬细胞向M2表型极化，从而显著促进糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型的创面愈合，为骨科再生医学提供了一种无细胞治疗新策略。

　　

1 引言

骨科相关疾病中的创面，尤其是糖尿病患者的慢性创面，由于血管损伤、反复感染和过度氧化应激，其临床管理面临重大挑战。不恰当的处理可能导致严重的后果，包括广泛的组织损伤、败血症、骨髓炎和截肢。尽管各种生物材料在创面修复中取得部分成功，但大多数难以适应复杂的糖尿病和骨科微环境，限制了精确的组织再生。因此，开发能够响应骨科相关糖尿病创面特定微环境、可控释放生物活性分子、减轻氧化应激、激活血管生成并恢复局部血流的系统至关重要。

糖尿病创面的生理pH值呈弱酸性，而在糖尿病和感染的骨科创口中，乳酸和乙酸的产生进一步将pH值降低至4.5-6.5。水凝胶具有三维交联亲水聚合物网络，具有良好的生物相容性和渗透性，能够模拟细胞外基质。当负载治疗剂时，水凝胶可作为生物活性分子持续释放的储库。鉴于骨科相关糖尿病创面在位置、大小和深度上的可变性，一种可注射、自愈合、pH响应的水凝胶系统至关重要。

外泌体是间充质干细胞（MSCs）的旁分泌介质，能够促进创面修复。MSC来源的外泌体携带生物活性分子，继承了干细胞再生功能的同时避免了细胞免疫反应，具有强大的促血管生成能力，可实现无细胞治疗。然而，其有限的抗氧化和抗炎能力限制了其在糖尿病骨科创面中的疗效。研究表明，用物理或化学刺激预处理MSCs可以增强外泌体的生物活性。姜黄素是一种天然多酚，具有已证实的抗炎、抗氧化和抗菌特性。基于生物活性物质可增强MSC来源外泌体旁分泌潜力的新兴证据，姜黄素可用于预处理骨髓MSCs，在保留其促血管生成活性的同时，增强其抗氧化和抗炎能力。因此，一种设计用于响应性释放姜黄素预处理外泌体（Cur-Exos）的水凝胶，可以综合利用其抗氧化、抗炎和促血管生成作用来应对骨科创面修复的挑战。

本研究开发了一种pH响应、可注射、自愈合水凝胶，专为糖尿病骨科创面的弱酸性微环境（pH 4.5-6.5）设计。该水凝胶通过两性羧甲基壳聚糖（CMC）和四臂聚乙二醇苯甲醛（PEG-BA）之间的希夫碱交联形成。CMC固有的抗菌特性可抵御外部病原体和生物膜形成，这对于预防骨科创面感染至关重要。可逆的希夫碱键赋予水凝胶pH和剪切响应性，使其能够在酸性创面环境中特异性降解并控释Cur-Exos。

2 方法

2.1 苯甲醛封端的四臂PEG的合成

将四臂聚乙二醇（PEG）、4-甲酰基苯甲酸和4-二甲氨基吡啶（DMAP）溶解在无水四氢呋喃（THF）中，加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），在氮气氛围下磁力搅拌72小时。产物通过溶解在THF中，用冷无水乙醇洗涤三次，并在25°C真空烘箱中干燥72小时进行纯化。使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和¹H核磁共振（¹H NMR, 400 MHz, D₂O）对PEG-BA的化学结构进行表征。

2.2 羧甲基壳聚糖的合成

羧甲基壳聚糖（CMC）的合成参照先前报道的方法。简言之，将壳聚糖分散在50 wt% NaOH水溶液中，在-20°C下冷冻12小时。将混合物转移至含有异丙醇的烧瓶中，逐渐加入氯乙酸钠。反应在22°C下搅拌2小时，然后在60°C下继续搅拌2小时。用70%乙醇淬灭反应，沉淀依次用70%乙醇和无水乙醇洗涤，然后在60°C下干燥。通过FT-IR和¹H NMR（400 MHz, D₂O）对所得CMC进行表征。

2.3 CMC/PEG-BA水凝胶的制备

将200 mg CMC溶解在10 mL超纯水中，在室温下制备2% (w/v) CMC溶液。类似地，将250 mg PEG-BA溶解在10 mL超纯水中，得到2.5% (w/v) PEG-BA溶液。将等体积的CMC和PEG-BA溶液混合，涡旋30秒，并在25°C下孵育使其凝胶化，形成CMC/PEG-BA水凝胶。

2.4 BMSCs和BMSC外泌体的提取与鉴定

按照先前研究中的说明分离和培养骨髓基质细胞（BMSCs）。然后通过流式细胞术（FCM）用阳性标志物CD9和CD73以及阴性标志物CD45进行确认。用10 μM姜黄素预处理BMSCs 24小时（使用无外泌体胎牛血清）。收集上清培养基，在15,000 ×g下离心35分钟以去除死细胞。然后进行两次100,000 ×g离心，每次75分钟。最后，将收集的外泌体用磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬，并在-80°C下保存以供后续实验。通过透射电子显微镜（TEM）观察Cur-Exos和NC-Exos的超微结构和形状。同时，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）评估外泌体的粒径。通过蛋白质印迹法检测CD63、CD9和钙联接蛋白。

2.5 体外细胞存活和迁移实验

为了评估外泌体对细胞迁移的影响，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种在24孔板中培养24小时。然后将细胞血清饥饿过夜以同步其生长状态。使用200 μL移液器吸头创建线性微损伤，然后用PBS洗涤以去除碎片。用浓度为20 μg/mL的外泌体处理HUVECs，并在24小时内监测和成像伤口闭合情况。使用ImageJ软件量化伤口面积，计算伤口闭合百分比和迁移速率。为了评估外泌体对细胞存活的影响，将HUVECs暴露于不同组的处理24-48小时。使用钙黄绿素AM/碘化丙啶（PI）活死细胞染色试验评估细胞活力，以确定活细胞比例。

2.6 活性氧物种测定和管形成实验

使用活性氧物种测定试剂盒（DCFH-DA）测量细胞ROS清除活性。简言之，将培养在6孔板中的HUVECs分为五组：对照组、T-BHP组、PEG-CMC组、NC-Exo@组和Cur-Exo@组。除对照组外，所有其他组均暴露于75 μM t-BHP中6小时。然后将每组细胞在37°C下用10 μM DCFH-DA避光染色30分钟。随后使用荧光显微镜或流式细胞仪观察细胞内ROS水平。为了评估不同处理组的毛细血管样结构形成能力，进行了管形成实验。简言之，将Ceturegel? Matrix LDEV Free在4°C下完全融化过夜。然后将50 μL Ceturegel? Matrix添加到预冷的96孔板中，再置于培养箱中30分钟备用。将来自不同预处理组的HUVECs以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种到96孔板上，并培养4小时。使用倒置光学显微镜验证管形成能力，并通过ImageJ进行分析。

2.7 流式细胞术和免疫荧光染色

进行流式细胞术以检测巨噬细胞极化。将RAW264.7细胞在不同组中培养，然后以10⁶个细胞/100 μL的密度重悬备用。简言之，在与表面抗原CD206孵育30分钟之前，用Fc阻断剂在4°C处理细胞悬液10分钟。对于细胞内抗原染色，将细胞与一抗CD11C和CD86孵育。然后根据制造商的建议，用细胞染色缓冲液洗涤两次。最后，将细胞重悬并通过流式细胞仪进行分析。使用FlowJo V10.0分析数据。

将RAW264.7细胞在不同组中培养3天，然后用4%多聚甲醛固定25分钟。随后用0.2% Triton X-100透化，并在室温下用5%牛血清白蛋白封闭30分钟。在4°C下与一抗CD206、CD163和iNOS孵育过夜后，将细胞在避光条件下用二抗处理30分钟。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核染色5分钟。最后，使用荧光显微镜捕获免疫荧光图像，并使用ImageJ软件量化荧光强度。

2.8 蛋白质印迹法

收集RAW264.7细胞或外泌体，洗涤两次，然后用RIPA裂解缓冲液裂解。应用BCA法检测蛋白质浓度。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质后，将其转移到PVDF膜上。在室温下用5% BSA封闭膜1小时后，与一抗（如Ikβ-α、p65、p-p65、CD63、CD9、钙联接蛋白和GAPDH）在4°C下孵育过夜。最后，使用增强化学发光法显示目标蛋白的表达。

2.9 动物模型伤口愈合实验

所有SD大鼠（雄性，300 g ± 30 g）由贵州中医药大学提供。按照先前的报告建立大鼠糖尿病模型。简言之，通过静脉注射链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病。当血糖浓度连续四天超过16.7 mM时，认为糖尿病模型建立成功。然后将糖尿病SD大鼠随机分为对照组、PEG-CMC组、NC-Exo@组和Cur-Exo@组。使用小型动物麻醉机输送异氟烷对大鼠进行麻醉。用3%–5%异氟烷在100%氧气（流速：1 L/min–2 L/min）中麻醉大鼠直至意识丧失，然后在创建15 mm × 15 mm方形全层伤口期间维持1.5%–2.5%异氟烷麻醉。在伤口建立后的第0、5和10天，使用数码相机记录伤口愈合情况。在第10天，处死每组大鼠。在专用腔室中使用二氧化碳（CO₂）吸入法实施安乐死，以每分钟30%–70%腔室体积的速率逐渐填充以诱导无意识，然后持续暴露直至确认呼吸和心脏活动停止。进行颈脱臼作为次要方法以确保死亡。采集伤口部位组织样本用于苏木精和伊红（H&E）染色、Masson三色染色和免疫组织化学（IHC）染色。使用ImageJ分析伤口面积的变化。

2.10 组织学分析和免疫组织化学染色

将伤口组织在4%多聚甲醛中固定并石蜡包埋。然后将组织切成5 μm厚的切片用于组织学分析。应用H&E和Masson三色染色观察不同治疗方法下的再生能力和胶原形成。按照标准方案进行IHC染色。脱蜡去除石蜡并水化后，将切片在PBS中洗涤，并浸入3% (v/v)过氧化氢中5分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性。切片与以下一抗孵育：抗-iNOS和抗-CD206。每组分析三只动物的IHC染色。对于每个样本，随机选择至少五个视野进行分析。

2.11 统计分析

数据表示为三次或以上分析的平均值±标准差。使用GraphPad Prism通过单因素方差分析和Tukey检验比较数据。p < 0.05为显著性阈值（NS，不显著；p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001）。

3 结果与讨论

3.1 BMSCs和Cur-Exos的制备与表征

首先，使用光学图像和流式细胞术分析鉴定分离培养的BMSCs。从SD大鼠中获取BMSCs。FCM数据证实BMSCs高表达阳性标志物CD90和CD73，但阴性标志物CD45的表达水平极低。表达率分别为97.1%、96.2%和0.30%。上述结果表明BMSCs被成功提取并表现出MSC特性，与先前研究一致。BMSCs与姜黄素一起孵育以收集上清液。然后通过超速离心从经姜黄素处理或未处理的BMSCs上清液中分离外泌体，并通过NTA、TEM和蛋白质印迹法进行表征。Exo和Cur-Exo的形态均具有典型的外泌体结构，具有明显的脂质双层膜囊泡。它们的直径约为120 nm，两者之间无显著差异。NTA数据显示Exo和Cur-Exo的尺寸范围在30至300 nm之间，两者无显著差异。通过蛋白质印迹分析在Exo和Cur-Exo组中检测到外泌体表面标志物CD9和CD63，但阴性标志物钙联接蛋白在它们中不表达。这些结果共同证实分离的Cur-Exos符合BMSC来源外泌体的标准。

3.2 水凝胶的合成、可注射性和自愈合性能

PEG-CMC水凝胶基于CMC和4臂PEG-BA在室温下形成。与CMC混合后，4臂PEG-BA溶液可在几秒钟内轻易转变为稳定的水凝胶。该水凝胶可以使用内径为0.5 mm的注射器针头轻松注射。一部分用亚甲蓝染成蓝色，另一部分不染色。附着10分钟后，两部分水凝胶结合在一起，可以用镊子向任何方向提起而不会散开。扫描电子显微镜分析显示，水凝胶呈现高度有序的多孔结构，有利于营养和气体交换的有效通道。评估了水凝胶的pH响应降解行为。水凝胶在pH 5.5下的降解速度明显快于pH 7.4，突出了其对酸性环境的敏感性。总的来说，水凝胶的可注射性和自愈合能力表明它可以适应不同形状的糖尿病创面。作为外泌体载体，水凝胶的pH敏感特性有利于外泌体在局部糖尿病环境中的释放。所有这些属性表明，该水凝胶是一种有前景的响应性载体，可用于改善糖尿病伤口愈合。

3.3 外泌体的体外释放、水凝胶的生物相容性和抗菌活性

与糖尿病和其他骨科疾病相关的慢性创面极易受到细菌感染，导致持续炎症和弱酸性细胞微环境。本研究开发的外泌体负载水凝胶设计用于在此类酸性条件下释放其生物活性物质。水凝胶在pH 5.5下表现出比中性pH 7.4下明显更快的外泌体释放，表明其具有pH响应行为，能够在慢性创面的酸性微环境中快速递送治疗性外泌体，从而增强生物功效。由于水凝胶直接接触细胞，其优异的生物相容性对于促进组织再生至关重要。在这项研究中，使用HUVECs的活/死染色试验在体外评估了水凝胶的生物相容性。在水凝胶提取物中培养24小时和48小时的HUVECs在所有组中均表现出完全的细胞铺展。水凝胶组的荧光强度与对照组相当或超过对照组，而外泌体负载水凝胶组的荧光强度相对于对照组显著更高，所有差异均具有统计学意义（p < 0.05）。这一结果表明PEG-CMC水凝胶具有优异的生物相容性，并且外泌体负载水凝胶可以促进HUVEC增殖。

除了优异的pH响应特性和生物相容性外，具有内在抗菌活性的伤口敷料材料对于促进骨科应用的伤口愈合更具优势。使用大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）评估了PEG-CMC水凝胶敷料的抗菌活性。与对照组相比，PEG-CMC水凝胶组的平板菌落数对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均减少了50%以上，证明PEG-CMC水凝胶具有固有的抗菌特性。PEG-CMC水凝胶的抗菌功效归因于希夫碱活性键和质子化氨基，它们与带负电荷的细菌表面结合，从而破坏其膜并导致细菌死亡。总之，PEG-CMC水凝胶表现出pH响应特性，能够在骨科创面的酸性微环境中释放外泌体。此外，其优异的生物相容性和有效的抗菌活性使其成为骨科应用的理想伤口敷料。

3.4 Cur-Exo@凝胶的抗氧化作用及促血管生成能力

骨科背景下的慢性创面常因缺氧和高血糖微环境而复杂化，导致ROS的过量产生。升高的ROS水平会加剧组织炎症，诱导细胞坏死，并损害组织修复过程。因此，减轻创面微环境中过度的氧化应激对于促进骨科应用的有效创面修复至关重要。因此，我们研究了负载DCFH-DA的HUVECs中水凝胶的抗氧化作用。将HUVECs用不同的水凝胶提取物预处理12小时，然后暴露于75 μm TBHP（叔丁基过氧化氢）以模拟氧化应激。负载Cur-Exo水凝胶组的细胞的荧光强度低于TBHP处理组。NC-Exo水凝胶组的平均荧光强度不到TBHP组的一半。这些发现证明，来源于BMSCs的Exo和Cur-Exo具有显著的抗氧化特性。值得注意的是，Cur-Exo组表现出最高的抗氧化功效，突出了其在减轻骨科伤口愈合应用中氧化应激方面的潜力。

血管生成是伤口愈合中的关键机制，特别是在骨科背景下，细胞迁移是新生血管形成的关键步骤。随后，我们进一步研究了用不同水凝胶组处理的HUVECs的血管生成能力。将细胞与水凝胶洗脱液共培养24小时后，进行划痕实验以评估水凝胶对HUVEC迁移的影响。研究结果表明，Cur-Exo水凝胶组实现了最显著的伤口闭合，仅剩5%的伤口面积，而NC-Exo组为13%。与伤口面积测量结果一致，Cur-Exo水凝胶组的迁移距离最长。进行管形成实验以检测不同水凝胶组的血管生成能力。然后将预处理的HUVECs收获并接种在基质材料表面4小时。与PEG-CMC组相比，Cur-Exo@gel组中的网格数、交叉点和分支数更多，接近对照组观察到的水平。结果表明，姜黄素预处理的BMSC外泌体具有抗氧化作用并促进血管生成能力，表明其功能特性通过姜黄素得到增强。总之，Cur-Exo@Gel不仅发挥抗氧化作用，还能促进内皮细胞迁移，增强体外血管生成，改善局部血液供应，并增强促进骨科相关创面快速修复的能力。

3.5 Cur-Exo@Gel对体外巨噬细胞极化的影响

慢性创面暴露于过度的炎症刺激，导致驻留巨噬细胞持续向促炎（M1）表型极化。调节巨噬细胞极化以重塑炎症微环境是生物材料介导的伤口愈合的关键。在这项研究中，用脂多糖（LPS）处理RAW264.7巨噬细胞以诱导炎症反应，模拟慢性创面微环境。在炎症条件下，巨噬细胞主要维持M1表型，导致持续炎症。

降低M1巨噬细胞的比例同时增加M2巨噬细胞群对于减轻局部炎症和促进组织再生至关重要。CD206和CD163是M2巨噬细胞的标志物，而CD11C、CD86和iNOS是M1巨噬细胞的标志物。为了进一步研究Cur-Exo@Gel对巨噬细胞极化的影响，进行了流式细胞术和免疫荧光分析。Cur-Exo@Gel组显示出比LPS处理组（5.72%）显著更高比例的CD206阳性RAW264.7巨噬细胞（14.3%）。CD206表达的免疫荧光分析显示，外泌体负载水凝胶组的荧光强度显著高于对照组（p < 0.05）。然而，不同外泌体组之间未观察到统计学显著差异。外泌体负载水凝胶组显示出比对照组更高的CD163阳性巨噬细胞荧光强度（p < 0.05）。结果表明外泌体负载水凝胶促进M2巨噬细胞极化。然而，Cur-Exo水凝胶对M2极化未显示出强效作用。

Cur-Exo@Gel组中CD86⁺巨噬细胞（M1型）的比例降至6.86%，而对照组为27.9%。同时，Cur-Exo@Gel组中CD86⁺巨噬细胞的百分比（64.5%）低于对照组（90.7%）。经典M1巨噬细胞标志物iNOS的表达在用Cur-Exo@Gel处理后显著降低。因此，研究结果表明，Cur-Exo@Gel显著降低了促炎M1巨噬细胞的比例，这通过流式细胞术和免疫荧光分析得到证实。M2标志物的轻微上调可能归因于所使用的特定姜黄素浓度（10 μm），其优先抑制M1极化。先前的研究已确定姜黄素通过抑制NF-κB p65磷酸化发挥抗炎作用，主要是通过稳定IκB-α和抑制IκB激酶（IKK）活性。为了阐明Cur-Exo@Gel促进巨噬细胞极化的潜在机制，进行了蛋白质印迹分析。Cur-Exo@Gel上调IκB-α表达，导致磷酸化p65水平显著降低，从而减少M1巨噬细胞的比例，并促进有利于骨科伤口愈合的抗炎微环境。

3.6 体内伤口愈合研究

为了研究水凝胶对慢性骨科伤口愈合的治疗潜力，在STZ诱导的糖尿病大鼠（60 mg/kg，腹腔注射）适应环境后，建立了全层皮肤缺损模型。在糖尿病大鼠背部创建直径为15 mm的全层皮肤缺损，然后用各种水凝胶处理。在术后第5天和第10天评估伤口愈合情况，并在第10天采集组织。Cur-Exo@Gel组表现出比对照组显著减小的伤口面积（p < 0.05）。NC-Exo@Gel组在伤口闭合方面显示出可比趋势，尽管伤口面积仍略大于Cur-Exo@Gel组。这些结果表明，Cur-Exo@Gel和NC-Exo@Gel都能加速慢性伤口愈合，其中Cur-Exo@Gel表现出更优的功效。为了进一步阐明治疗效果，进行了H&E和Masson三色染色，结果显示Cur-Exo@Gel显著增强了上皮细胞迁移，减少了伤口距离，并促进了胶原沉积。为了探讨炎症调节对巨噬细胞极化的影响，进行了iNOS和CD206的IHC分析。Cur-Exo@Gel组显示iNOS表达显著降低，这表明M1巨噬细胞活性降低，而CD206表达未见显著增加，表明体内M2极化增强有限。

4 结论

在本研究中，我们成功开发了一种由Cur-Exo和PEG-CMC组成的pH响应性、高生物相容性、可注射和自愈合水凝胶，通过希夫碱交联形成。我们的研究结果表明，该水凝胶能够在糖尿病骨科创面的弱酸性微环境（pH 4.5）中实现靶向外泌体释放，表现出优异的可注射性和自愈合性能，以满足不规则骨科创面的需求。体外实验证实，Cur-Exo@Gel显著减轻内皮细胞氧化应激，促进内皮细胞迁移，并增强血管生成。此外，Cur-Exo@Gel通过上调IκBα表达和抑制p65磷酸化，降低了促炎M1巨噬细胞的比例，从而改善了炎症创面微环境。在糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型中的体内研究表明，Cur-Exo@Gel显著减少了伤口面积，并伴有增强的上皮迁移和胶原沉积。免疫组织化学分析进一步证实了iNOS表达的降低，表明M1活性受到抑制。这种无细胞治疗策略为慢性骨科创面的修复提供了新的见解，并为再生骨科的临床转化提供了一种有前景的方法。