去氨加压素（DDAVP）体外对健康志愿者血小板功能和微凝块形成的直接激活作用研究

《Advances in Hematology》：The Endothelial-Independent Effect of Desmopressin, In Vitro, on Platelet Function

本研究首次通过体外实验证实，去氨加压素（DDAVP）在不依赖内皮细胞的情况下，能通过血栓弹力图（TEG）和荧光显微镜检测到血小板活化和微凝块形成增强，挑战了DDAVP仅通过内皮细胞释放血管性血友病因子（vWF）发挥促凝作用的传统观点，为理解其多机制促止血作用提供了新见解。

　　

引言

血小板是初级止血级联反应放大和传播的核心。去氨加压素（DDAVP）作为一种抗利尿激素（ADH）的类似物，已知可通过与血管内皮相互作用来增强血小板功能。自1977年首次使用以来，近50年来这一作用机制被用于治疗A型血友病和血管性血友病（vWD）患者的出血。

自20世纪80年代以来，关于DDAVP是否仅通过此单一机制与血小板相互作用一直存在争议。体外和体内证据表明，可能存在替代的作用机制。ADH这种天然存在的神经垂体激素已知通过V1受体激活血小板。Yang等人的研究表明，与DDAVP预孵育的血小板会与ADH竞争V1受体。尽管该研究并未支持DDAVP能直接激活血小板，但它强调了DDAVP通过尚未完全阐明的机制与血小板相互作用。

2014年，Colucci等人研究了DDAVP对先天性轻度血小板功能障碍患者体内血小板功能的影响。他们的结论是，DDAVP对血小板聚集的部分作用是通过增加血管性血友病因子（vWF）浓度来介导的，进而增强了激动剂诱导的血小板聚集。他们的工作并不支持DDAVP对血小板聚集有直接作用，但提示了涉及钠泵激活和细胞内钙浓度持续升高的替代性血小板活化机制的可能。这些发现得到了Tomasiak等人早期研究的支持，他们表明DDAVP介导的血小板促凝作用可被钠氢交换泵抑制剂EIPA所减弱。

糖蛋白（GP）IIb/IIIa在血小板-血小板聚集以及血小板与血管内皮的结合中起着至关重要的作用，因为它为vWF和纤维蛋白原提供了结合位点。Reiter等人研究了DDAVP对接受GP IIb/IIIa抑制剂治疗的健康个体的影响。他们表明，DDAVP加快了由GP IIb/IIIa抑制剂引起的体外血小板功能障碍的正常化速度。考虑到目前公认的DDAVP诱导的促凝作用是通过增加vWF水平来介导的，这项研究进一步证明DDAVP对血小板功能的影响及其完整作用机制尚未被完全理解。Cattaneo等人的研究也支持了这一论断，他们显示在严重vWD患者中，即使vWF水平已通过冷沉淀输注校正至正常浓度，DDAVP仍能进一步纠正出血时间。

因此，本研究旨在确定DDAVP在体外对健康志愿者样本中血小板功能的影响。

材料与方法

研究设计

这项横断面分析性、基于实验室的体外研究分析了20名健康志愿者的血液样本。研究获得了南非斯泰伦博斯大学人类研究伦理委员会的伦理批准。研究按照《赫尔辛基宣言》的原则进行。研究在2023年6月至7月期间进行。

研究人群

通过便利抽样招募了20名年龄在18至50岁之间的健康、非怀孕志愿者参与研究。参与者由主要研究者根据既定标准进行筛选，以确定是否符合参与资格。所有参与者均签署了知情同意书。

样本量

计算得出至少19名参与者的样本量足以使研究达到0.8的效能，α值小于0.05。使用的统计软件是Stata 17版。

数据收集

使用21G BD Eclipse针头和BD Vacutainer一次性持针器获取筛查血样。采集全血样本用于筛查测试：血红蛋白浓度、血小板计数、凝血酶原时间/国际标准化比值（PT/INR）、活化部分凝血活酶时间（aPTT）和尿素。前20名符合纳入和排除标准的参与者被纳入研究。

符合条件的参与者收到了一份关于在接下来10天内需避免的特定食物和药物的信息文件。在第11天，将血液样本采集到六个4.5 mL 3.2%柠檬酸钠缓冲管（柠檬酸盐管）、一个带有喷雾涂层K2EDTA的3.0 mL全血管以及一个含有硅胶促凝剂、聚合物凝胶和硅酮涂层内壁的4.0 mL SST管中。

使用血栓弹力图（TEG6s）和血小板功能分析仪（PFA-200系统）分析参与者样本。血液样本还使用荧光显微镜进行了分析。

样本制备

三个柠檬酸盐管作为对照进行处理：一个用于TEG分析，两个用于PFA-200和荧光显微镜（血小板分析和微凝块分析）。向剩余的三个柠檬酸盐管中加入5 μL DDAVP（静脉注射安瓿，4 μg/mL）。对DDAVP测试样本进行与对照相同的分析。样本在采血后30分钟至4小时内处理，并在室温下保存。

INNOVANCE PFA-200系统由使用两个独立测试盒进行的单独测试组成：胶原/肾上腺素（CEPI）和胶原/腺苷二磷酸（CADP）测试盒。对每个对照和测试样本均进行了两项测试。测试通过将枸橼酸钠抗凝全血样本移液到含有储存器、毛细管和衬有浸渍了指定激动剂的膜的孔径的CEPI和CADP测试盒中进行。当血流因血小板聚集而停止时，记录孔径闭合时间。

与使用杯状样品杯的旧一代TEG 5000不同，TEG6s使用一次性测试盒（全球止血测试盒）。该测试盒制造时有四个独立的通道，预装了四种不同的检测方法：高岭土TEG、含肝素酶的高岭土TEG、快速TEG和TEG功能性纤维蛋白原检测。

使用制造商提供的转移移液器将枸橼酸钠抗凝全血（对照和测试样本）移液到测试盒样品端口。然后将测试盒插入TEG6s止血分析仪中运行至完成。数据从高岭土TEG的结果中收集。

乏血小板血浆（PPP）和血细胞比容层中血小板的制备

为每位参与者制备一个对照和一个测试柠檬酸盐样本。PPP通过以3000 RPM离心15分钟制备。这些显微镜制备方法已在多篇论文中讨论过。每个样本的血细胞比容部分用于研究血小板脆性。与研究添加了稳定剂以防止活化的全血、血沉棕黄层或富血小板血浆中的血小板的传统方法不同，我们的方法涉及离心全血以产生PPP，并研究剩余血细胞比容部分中的血小板。我们有意避免添加血小板稳定剂，因为我们的目标是比较处理和未处理样本中血小板的脆性。使用稳定剂或抑制剂可能会干扰我们添加到样本中的DDAVP的效果，可能混淆我们的结果。同样经过离心的未处理样本作为我们评估离心过程所致血小板活化的对照。

PPP中微凝块的分析

PPP部分含有纤维蛋白（原）和血浆蛋白的凝块，也称为微凝块。这些微凝块在健康样本中也少量存在。为了观察PPP中的微凝块（在暴露于DDAVP之前和之后），将硫黄素T（ThT）（暴露浓度：5 μM）添加到PPP中并孵育30分钟。将3 μL样本滴在显微镜载玻片上后，使用配备Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC M27物镜的Zeiss Axio Observer 7荧光显微镜，在450–488 nm激发波长和499至529 nm发射波长下观察样本。

血细胞比容血小板分析

制备血细胞比容样本并移除PPP后，将两种荧光标记物CD62P（用于P-选择素）和PAC-1（用于活化的GP IIb/IIIa）添加到血细胞比容中。CD62P/P-选择素在血小板活化期间从细胞颗粒中释放，然后移动到血小板膜表面。PAC-1抗体检测活性GP IIb/IIIa的新表位。PAC-1抗体结合与血小板活化相关。将PAC-1和CD62P/P-选择素标记物应用于20对样本中的未处理（对照）和DDAVP暴露样本。来自未处理（对照）样本的PAC-1和CD62P/P-选择素信号作为评估相应DDAVP暴露样本中血小板活化的基线。样本在室温下孵育30分钟后，同样使用配备Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC M27物镜的Zeiss Axio Observer 7荧光显微镜观察样本。我们使用了406–440 nm激发波长和546–564 nm发射（PAC-1），以及494–528 nm激发和618–756 nm发射（CD62P）。

数据分析

使用Stata 17版进行PFA-200和TEG数据分析。使用GraphPad 10.3对微凝块和血小板活化评分进行统计分析。分类数据以频率和百分比表示。Shapiro-Wilk检验用于评估数据分布。从TEG（R时间、K时间、角度和MA）和PFA-200收集的定量数据是参数性、连续数据，具有两个配对组，因此使用配对t检验进行分析。来自荧光显微镜和TEG LY30的定量数据是非参数配对数据，并使用Wilcoxon符号秩检验进行分析。差异/效应报告为均差及其95%置信区间。显著性（α）设定为5%。

血浆微凝块形成和血小板活化、铺展及聚集的分级系统

我们使用了Laubscher等人先前开发的血小板和微凝块分级系统。我们还使用了他们的分级系统来评估微凝块的存在和血小板活化。结合TEG分析，这种分级可以深入了解凝血病理学。

结果

我们测试了20名健康志愿者的血液样本，其中11名男性和9名女性。人群基线特征和筛查结果如表3所示。

PFA-200

根据PFA-200测试的血小板功能显示，CADP和CEPI测试的对照和测试样本均值之间无统计学显著差异。均值差异分别为0.2秒和0.0秒。

VET测试（TEG6s）

血栓弹力图显示，测试样本的K时间均值（1.49分钟±0.26）与对照样本（均值1.61分钟±0.26）相比显著减少了0.11分钟。还注意到DDAVP样本的MA增加了0.555 mm。在R时间或角度方面，未发现对照和测试样本均值之间存在差异。

图2和图3显示了暴露于DDAVP之前和之后的血小板和PPP。我们还使用我们的微凝块和血小板分级系统对微凝块和血小板活化进行了评分。暴露于DDAVP后存在显著的微凝块形成。注意到显著的血小板铺展，但未发现显著的血小板聚集。

讨论

我们研究了DDAVP在临床适用浓度下，在没有血管内皮存在的情况下对血小板功能的影响。TEG分析显示K时间减少和MA增加。检查微凝块形成（主要是纤维蛋白和血浆蛋白）以及血小板活化的荧光显微镜显示，DDAVP测试样本中的这两个参数均显著增加。

在我们的研究中，将DDAVP体外添加到血液样本中，并未显示对两组激动剂中任何一组的PFA-200孔径闭合时间有影响，均值差异分别为0.2秒和0.0秒。2014年的一项体内研究表明，DDAVP将COL/ADP和COL/EPI PFA-200孔径闭合时间分别缩短了40秒和68秒。内皮的存在或缺失并非这些研究之间唯一显著差异，因为Colucci等人的研究人群招募了患有原发性血小板功能缺陷的患者。DDAVP的加入可能能够通过vWF抗原（vWF:Ag）的短暂升高，使病理受试者的血小板功能恢复到正常凝血参数范围内；然而在我们的研究中未观察到任何效应，可能是因为血小板的vWF:Ag储存量远小于内皮细胞提供的量，因此DDAVP无法促进血小板功能的任何改变。

先前使用VET测试的研究未显示任何效应。TEG K时间代表凝血块振幅从2 mm进展到20 mm所需的时间，而TEG MA代表血栓的最大强度。K时间和MA均受纤维蛋白原浓度、血小板计数和血小板功能的影响。在DDAVP样本中观察到的TEG K时间和MA的促血栓形成变化彼此一致，表明影响它们的一个或多个参数得到了增强。由于这些输出是相互作用血液成分的综合结果，仅从该分析无法确定哪个/哪些参数发生了改变。

检查微凝块形成的荧光显微镜结果为了解TEG数据中的促血栓形成发现提供了合理解释。由此我们可以推断，K时间和MA可能同时受到纤维蛋白形成增加和血小板功能增强的影响。然而，无法确定一种效应是否比另一种更突出，或者一种效应是否 solely 负责观察到的变化，而另一种效应是由于未知的混杂因素而偶然观察到的。据我们所知，这是首次证明这种效应的研究。

虽然PPP通常被认为不含完整细胞，但在3000 × g离心15分钟后，必须承认少量细胞碎片（包括来自血小板或循环内皮细胞的碎片）可能残留并被困在纤维蛋白样微凝块复合物中。这些结构被ThT显著染色，表明其淀粉样蛋白含量高，与血浆蛋白错误折叠一致。因此，我们将图3中看到的较大结构解释为错误折叠的纤维蛋白（原）和其他血浆蛋白的聚集体，可能掺入了残留的膜碎片。不能排除循环内皮源性物质的存在，这可能反映了DDAVP诱导的独立于vWF释放的促血栓反应，既往研究显示DDAVP诱导内皮细胞暴露组织因子支持了这一可能性。使用内皮细胞特异性标记物的进一步研究可能有助于阐明这种可能性。

这项研究的结果虽然是阳性的，但应结合以下认识来解读：迄今为止的血小板功能测试领域尚未就DDAVP是否对血小板功能有直接影响提供任何明确答案。这可能看起来是直觉性的；但值得注意的是，这个问题已被广泛研究，许多研究支持和反驳DDAVP对血小板功能有直接影响的结论。在血小板功能分析方法、测试时间、DDAVP剂量、体外与体内测试以及人群选择方面的异质性可能解释了这些相互矛盾的结果。

研究的局限性包括便利抽样，以及所有研究者均未对哪些是测试样本和对照样本设盲。受此影响最大的领域可能是荧光显微镜数据，因为这容易受到检查载玻片者的确认偏倚和观察者偏倚的影响。流式细胞术的加入将提供更可靠的血小板活化定量测量，并限制观察者偏倚的影响。应注意，该研究仅限于18-50岁的健康成年人，因此结果不能临床推广至极端年龄患者或患有潜在血液病的患者。

结论与建议

据我们所知，这是首次通过体外研究证明DDAVP对通过VET测试和荧光显微镜检查的促血栓形成参数有积极影响。DDAVP体外暴露与凝块形成增强之间存在关系。荧光显微镜证实DDAVP在不依赖内皮细胞介导的机制下激活血小板。这为通过更严格地探究DDAVP对血小板功能和促血栓级联的体外效应来改进本研究提供了机会，这对未来的药理学操作可能很重要。未来的研究将受益于更大的研究样本量和双盲设计。额外的测试形式，如全血阻抗聚集测定法、光透射聚集测定法和流式细胞术，将为了解DDAVP体外对血小板的影响提供更具体的见解。人群抽样应是随机的，纳入更广泛的人群（包括孕妇和儿科人群）将有助于进一步阐明DDAVP与血小板和血浆蛋白的相互作用。