Nbeal2缺失通过Abl1稳定化引发肥大细胞中多药耐药蛋白MDR1（ABCB1）的亚细胞定位紊乱

《Immunology》：Nbeal2 Inactivation Triggers Abl1 Stabilisation and Dysregulated Subcellular Localisation of the Multi-Drug-Resistant Protein MDR1 (ABCB1) in Mast Cells

本研究发现BEACH家族蛋白Nbeal2通过调控Abl1稳定性影响多药耐药蛋白ABCB1的膜定位。Nbeal2缺失导致肥大细胞出现ABCB1膜表达异常升高，该过程受IL-33-TAK1-IKK2信号轴和Src家族激酶的动态调控。这项研究揭示了GPS发病新机制，为肿瘤多药耐药性研究提供了新视角。

　　

1 Materials and Methods

1.1 Mice

研究使用8-12周龄的野生型（wt）和^?/?基因敲除小鼠（同窝仔鼠），所有动物实验均获图林根州消费者保护与食品安全局批准（许可证号：twz-36-2017和twz-08-2023）。

1.2 Generation of Bone Marrow Derived Mast Cells (BMMCs)

通过4周体外培养获得骨髓来源肥大细胞，培养基中添加含IL-3的条件培养基。每2天更换培养基去除贴壁细胞，通过流式细胞术检测c-Kit⁺细胞ABCB1表达，培养4周后CD117⁺/FcεRI⁺细胞纯度需达95%。

1.3 Culturing of Cell Lines

P815、HMC-1.1、HMC-1.2及MC/9细胞系采用RPMI培养基培养，MC/9细胞额外添加IL-3条件培养基。

1.4 Expansion of Connective-Tissue MCs (CTMCs)

腹腔灌洗获取结缔组织肥大细胞，经SCF和IL-3诱导培养2-3周，c-Kit⁺/FcεRI⁺细胞纯度达90%-95%时用于实验。

1.5 Treatment and Stimulation of BMMCs and CTMCs

细胞经IKK抑制剂VII（1μM）、5Z-Oxozeanol（5μM）等抑制剂预处理30分钟后，用IL-33（50ng/mL）刺激，通过Western blot、流式细胞术和ELISA分析信号通路。

1.6 Lipid Mediator (LM) Metabololipidomics

采用UPLC-MS/MS系统定量分析脂质介质，校准曲线r²值≥0.998（脂肪酸≥0.95）。

1.7 RNA Sequencing and Analysis

从NCBI GEO数据库下载RNA-seq数据，按标准流程进行差异表达基因分析。

1.8 Cell Lysis and Western Blotting

细胞裂解液含1% Triton X-100，BCA法定量蛋白，10% SDS-PAGE分离后转膜，使用ECL检测磷酸化及总蛋白表达。

1.9 Rhodamine123 (Rh.123) Assays

通过Elacridar阻断ABCB1外排功能，37°C孵育后检测Rh.123荧光强度变化。

1.10 Flow Cytometry

抗体染色后采用LSR II流式细胞仪分析，碘化丙啶（PI）排除死细胞。

1.11 Cell Sorting and Culturing of Sorted Cells

通过流式分选获得ABCB1⁺和ABCB1^{? ?/?} BMMCs，IL-3培养基中培养后动态监测表型变化。

1.12 Western Blot Quantification

ImageJ软件量化蛋白条带，磷酸化水平以总蛋白为内参，以未刺激wt细胞为基准设值为1。

1.13 Statistical Analysis

数据以mean±SEM表示，Student t检验分析显著性，p≤0.05为差异显著。

2 Introduction

BEACH结构域蛋白NBEAL2在造血细胞特异性表达，其缺失引起灰色血小板综合征（GPS），表现为巨血小板减少和脾肿大。在肥大细胞中，缺失导致转录因子积累、蛋白质合成机制异常，进而引发非生理性生存和细胞因子过度产生。本研究揭示NBEAL2通过调控多药耐药蛋白ABCB1的膜定位影响肥大细胞功能的新机制。

2.1 Nbeal2 Regulates the Localisation of ABCB1 in MCs

肥大细胞白血病（MCL）患者存在3p21染色体区域杂合性缺失，该区域包含基因。在HMC-1.1、HMC-1.2和P815细胞系均检测到ABCB1高膜表达。与wt相比，^?/? BMMCs形成新的c-Kit⁺/ABCB1⁺细胞亚群，但总ABCB1蛋白量无变化。流式分选实验证实ABCB1^?细胞可自发转化为ABCB1⁺表型，该转化始于体外分化第3周。

2.2 IL-3 Is Not Required for the Localisation of ABCB1 on ^?/? BMMCs

IL-3剥夺虽引起细胞死亡增加，但不影响ABCB1膜表达。Rh.123外排实验显示^?/? BMMCs具有更强的底物外排能力，表明膜定位ABCB1具有功能活性。

2.3 Dysregulation of ABCB1 Is Also Detectable on ^?/? Connective-Tissue MCs (CTMCs) and MCs With CRISPR/Cas9-Mediated Deletion

在成熟CTMCs和CRISPR/Cas9敲除的MC/9细胞中均重现ABCB1膜表达异常，证实该现象是Nbeal2缺失的直接后果而非发育缺陷。

2.4 IL-33 Downregulates ABCB1 on ^?/? BMMCs

IL-33刺激8小时后开始下调ABCB1膜表达，16小时内持续作用，伴随c-Kit表达减弱，形成c-Kit^dim/ABCB1^?细胞亚群。分化阶段持续IL-33暴露可抑制ABCB1膜定位，但撤除刺激后表型可逆转。

2.5 The IL-33-Induced Generation of c-Kit^dim/ABCB1^{? ?/?} BMMCs Depends on the TAK1-IKK2 Module

TAK1抑制剂（5Z-7-oxozeanol）和IKK抑制剂VII可阻断IL-33介导的ABCB1/c-Kit下调，而Dynasore（发动蛋白抑制剂）、p38抑制剂（L-Skepinone）等均无此作用。p38 MAPK特异性参与c-Kit下调过程。

2.6 The Opposite Roles of Tyrosine Kinases in Resting and IL-33-Activated ^?/? BMMCs

酪氨酸激酶抑制剂Nilotinib单独处理可降低ABCB1/c-Kit膜表达，但能逆转IL-33引起的ABCB1下调。Nilotinib对IL-33诱导的细胞因子分泌抑制效果在wt细胞中更显著，提示酪氨酸激酶在静息和活化状态发挥双向调节作用。

2.7 Stabilised Abl1 Supports the ABCB1 Surface Localisation on Resting ^?/? BMMCs

磷酸化酪氨酸（pY）印迹显示^?/? BMMCs酪氨酸激酶活性增强。Abl1蛋白稳定性增加而LynB表达下降，转录组数据未见相应基因表达改变。Nilotinib处理可降低Abl1稳定性，伴随ABCB1膜表达减少，但总ABCB1蛋白量不变。

2.8 IL-33 Downregulated ABCB1 by SFKs

IL-33刺激30分钟内激活SFKs而非Abl1。SFK抑制剂SU6656可逆转IL-33介导的ABCB1下调，并抑制细胞因子产生。Nilotinib通过脱靶效应抑制SFKs激活，从而恢复ABCB1膜表达。

3 Discussion

Nbeal2缺失通过破坏颗粒稳定性导致ABCB1异常膜定位。分子对接提示NBEAL2的WDR结构域可与Abl1的SH2结构域相互作用，可能参与Abl1的泛素化降解调控。IL-33通过激活SFKs（主要是Lyn）拮抗Abl1的稳定作用，二者动态平衡调控ABCB1膜定位。该机制在肥大细胞增生性疾病和急性髓系白血病中具有潜在临床意义。

4 Conclusion

Nbeal2作为Abl1稳定性和ABCB1膜定位的负调控因子，其缺失通过Abl1-SFKs信号轴促进肥大细胞功能异常，为肿瘤多药耐药机制研究提供了新靶点。

Author Contributions

R.M.、N.A.和J.D.共同设计实验并完成数据分析；P.M.J.、C.K.等参与实验操作；B.N.和O.W.提供关键试剂；S.D.负责课题设计、实验实施、数据整合和论文撰写。

Acknowledgements

感谢CF下一代测序中心的Ivonne Goerlich提供技术支持。本研究由Projekt DEAL资助开放获取。