基于DNA甲基化模型精准诊断食管胃结合部腺癌上纵隔淋巴结转移的新策略

《Cancer Science》：Novel Methylation-Based Model for Accurate Diagnosis of Upper Mediastinal Lymph Node Metastasis in Esophagogastric Junction Adenocarcinoma

本文推荐一项创新研究：针对食管胃结合部腺癌（EGJAC）上纵隔淋巴结转移（UM-LNM）诊断难题，研究者开发了一种结合DNA甲基化（7个CpG位点）与临床参数的新型诊断模型。该模型在训练队列中曲线下面积（AUC）达0.87，验证队列中AUC为0.85，显著优于传统影像学方法，且甲基化谱是总体生存的独立预后因素（p<0.01）。研究成果以列线图形式呈现，为EGJAC的精准术前诊断与个体化治疗决策提供了重要工具。

　　

1 引言

食管胃结合部腺癌（EGJAC）的发病率在西方国家显著上升，亚洲国家也呈现类似趋势。尽管手术技术、围手术期管理和多学科治疗手段取得显著进展，EGJAC仍因其解剖位置复杂（跨越胸腔和腹腔）而成为预后极差的侵袭性恶性肿瘤。手术切除是EGJAC治疗的基石，手术方式和淋巴结清扫范围的选择通常基于食管侵犯长度。当食管侵犯长度超过4厘米时，由于上纵隔淋巴结转移（UM-LNM）风险增高，通常需进行经胸食管切除术合并纵隔淋巴结清扫。然而，经胸手术创伤更大、并发症发生率更高，且多项研究表明纵隔淋巴结转移患者预后极差，使得纵隔淋巴结清扫的治疗获益有限。因此，实现UM-LNM的精准术前诊断，有助于避免不必要的侵入性手术，并为原本计划接受经胸手术的患者选择更合适的治疗策略。

DNA甲基化作为重要的表观遗传调控机制，在肿瘤发生和发展中起关键作用，并已成为阐明恶性肿瘤临床特征的关键生物标志物。本研究利用公共甲基化数据库，筛选与EGJAC淋巴结转移（LNM）相关的CpG位点，进而开发并验证用于诊断UM-LNM的甲基化检测组合，最终通过整合肿瘤DNA甲基化信息与常规诊断策略，建立了一种新型的基于甲基化的模型，以提高UM-LNM的术前诊断准确性。

2 材料与方法

2.1 研究设计与患者队列

研究设计包括三个阶段：生物标志物发现阶段利用公共数据库（TCGA）的肿瘤DNA甲基化数据筛选与LNM相关的可转化CpG位点；训练阶段使用切除的肿瘤组织样本，通过甲基化特异性定量聚合酶链反应（MSP）验证所选生物标志物的性能，并整合生物标志物和临床特征开发新型UM-LNM诊断模型；验证阶段则采用独立的活检肿瘤组织样本队列验证该新型诊断模型的性能。上纵隔淋巴结根据第12版日本食管癌分类标准定义（包括No. 101、103、104、105、106、107、108和109组淋巴结）。

2.2 候选CpG位点的鉴定

研究人员分析了癌症基因组图谱（TCGA）数据库中的全基因组甲基化数据（Illumina Human Methylation 450K芯片），比较了69例下段食管腺癌（其中49例伴有淋巴结转移）的甲基化谱。通过差异甲基化分析（p值<0.05且|β值变化倍数|>0.225）和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归筛选出7个与LNM显著相关的CpG位点（cg21340148, cg24480695, cg06537894, cg02004418, cg12253819, cg18388891, cg05013064），这些位点均位于CpG岛内，且其在血液细胞中的甲基化频率较低，以尽量减少血细胞污染的影响。

2.3 患者队列与标本

本研究共纳入133例初治EGJAC患者的样本，包括79例切除肿瘤标本和54例术前内镜活检样本。所有患者均根据Nishi分类（肿瘤中心位于食管胃结合部2厘米范围内）病理诊断为EGJAC，并接受了根治性切除加淋巴结清扫术。收集了患者的临床病理资料，如年龄、性别、体重指数（BMI）、美国麻醉医师协会身体状况评分（ASA-PS）、肿瘤大小、浸润深度、血管侵犯以及术前食管肿瘤侵犯长度等。

2.4 DNA提取与亚硫酸氢盐转化

从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取基因组DNA，使用NanoDrop微量分光光度计系统进行定量。对提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理和平行纯化，获得亚硫酸氢盐转化的DNA（bsDNA）用于后续MSP检测。

2.5 甲基化特异性定量聚合酶链反应（MSP）检测

使用SYBR Green法进行MSP检测。针对7个候选CpG位点设计特异性引物，并利用梯度对照样本（完全甲基化与未甲基化基因组DNA混合）验证引物的甲基化特异性及生成标准曲线。以ACTB基因作为内参，采用2^?ΔΔCT方法相对定量目标CpG位点的甲基化水平。

2.6 统计分析

使用R软件和JMP Pro软件进行统计分析。采用LASSO Cox比例风险回归模型筛选CpG位点。通过受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）评估诊断模型的性能。利用决策曲线分析（DCA）评估模型的临床净获益。采用Cox比例风险模型估计死亡和术后肿瘤复发的风险比（HR）。使用列线图（Nomogram）可视化预测模型。p值<0.05认为具有统计学显著性。

3 结果

3.1 全基因组DNA甲基化谱分析鉴定EGJAC的LNM相关标志物

通过分析TCGA-ESCA（食管癌）的甲基化数据，比较LNM阳性与阴性组，发现了13个与LNM显著相关的低甲基化CpG位点。经LASSO回归进一步筛选，最终确定了7个核心CpG位点。这些位点在TCGA-ESCA队列中显示出良好的区分能力，且该队列的病例在基因组和表观基因组层面（主要为染色体不稳定（CIN）亚型和低甲基化表型（LME））相对均质。

3.2 在EGJAC训练队列中开发用于检测UM-LNM的DNA甲基化组合

鉴于UM-LNM患者预后极差，研究旨在开发能够准确识别该高危亚组的诊断工具。对训练队列切除肿瘤组织进行MSP检测，将7个靶标CpG位点的定量值通过特定logit公式整合，构建了组织DNA甲基化组合评分。该评分在UM-LNM病例中显著降低，其单独诊断UM-LNM的AUC为0.71（95% CI: 0.52–0.91）。此外，该甲基化组合还能有效分层患者的无复发生存期，显示出显著的预后潜力。

3.3 建立EGJAC患者新型UM-LNM诊断模型

多因素分析确定，除了甲基化组合评分外，基于影像学的临床UM-LNM诊断和食管侵犯长度是与UM-LNM显著相关的因素。因此，研究构建了一个整合了这三个因素的诊断模型。逻辑回归分析得出风险评分公式。虽然甲基化组合本身具有较好的诊断准确性，但其与临床因素结合后诊断性能显著提升，训练队列中的AUC达到0.87（95% CI: 0.75–0.99）。瀑布图分析进一步展示了基于风险评分对病例进行二分的能力（敏感性0.91，特异性0.76）。

3.4 在独立EGJAC队列中成功验证基于组织DNA甲基化检测的新型UM-LNM诊断模型

在独立的验证队列（54例患者）中，使用术前活检组织样本评估模型的性能。MSP检测显示，甲基化组合单独诊断UM-LNM的AUC为0.72（95% CI: 0.52–0.91）。当与临床因素结合后，诊断准确性进一步提高，AUC达0.85（95% CI: 0.70–1.00）。决策曲线分析表明，该整合模型相较于"全部手术"或"全部不手术"的策略，具有更高的临床净获益。生存分析显示，被模型判定为高风险的患者其复发时间更早，总生存期更差，提示这些患者可能存在隐匿转移灶。多因素Cox回归分析证实，CpG组合是总体生存的独立风险因素。为便于临床应用，研究还构建了用于预测UM-LNM风险和术后生存概率的列线图。

3.5 七个CpG标志物的探索性功能分析

初步功能分析显示，这7个CpG位点在胃体及胃窦起源的胃癌（TCGA-STAD）中，仅cg21340148与LNM相关，提示其余位点可能更具EGJAC特异性。甲基化水平与邻近基因表达的相关性分析表明，多数位点呈负相关。对正常食管胃结合部组织的分析发现，大多数CpG位点在生理状态下处于未甲基化状态，暗示其在肿瘤发生过程中经历甲基化，而在转移进展中可能发生去甲基化。

4 讨论

EGJAC的全球发病率持续上升，其治疗策略存在地域差异。对于疑似纵隔LNM的患者，东亚国家传统上倾向于根治性切除加扩大淋巴结清扫。然而，越来越多的证据表明纵隔淋巴结受累者预后极差，单纯手术效果有限。与此同时，西方国家已将围手术期化疗确立为标准治疗。然而，目前缺乏在治疗前识别高危患者的可靠工具。虽然氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（FDG-PET/CT）等影像学检查有一定价值，但其敏感性仍不理想。食管侵犯长度>4厘米是纵隔清扫的指征，但仅凭此标准可能导致部分非理想手术候选者接受过度侵入性治疗。

DNA甲基化是重要的表观遗传机制，异常甲基化模式积极参与肿瘤演进。本研究首次针对食管胃结合部腺癌，开发了一种用于UM-LNM风险分层的分子诊断工具。通过分析公共数据库和独立临床队列，验证了7个CpG位点组成的甲基化组合的诊断价值。将该甲基化特征与常规临床参数整合后，获得了卓越的UM-LNM诊断精度（AUC > 0.85）。值得一提的是，验证阶段使用的活检组织样本和相对简便经济的MSP检测方法，有利于该模型未来的临床转化应用。

本研究也存在局限性，包括UM-LNM阳性病例样本量有限，以及所有验证均在日本人群中进行，未来需要在更大规模、多种族的前瞻性研究中进一步验证。

总之，本研究通过全基因组DNA甲基化数据分析，建立了与EGJAC淋巴结转移相关的DNA甲基化组合，并在独立临床队列中验证了其用于UM-LNM术前诊断的价值。通过将该甲基化组合与常规诊断策略整合，显著提高了EGJAC患者UM-LNM的诊断准确性。这一新型DNA甲基化模型为实现EGJAC的精准术前诊断、优化治疗选择及推动个体化医疗提供了有力工具。结合食管侵犯长度和淋巴结影像学的DNA甲基化生物标志物模型，有望为EGJAC患者提供UM-LNM风险评估，从而制定个体化治疗策略，改善患者预后。