piR-hsa-164586通过调控MYH9/PI3K-AKT轴及EMT重塑非小细胞肺癌微环境促进侵袭转移的单细胞测序研究

《Interdisciplinary Medicine》：Single-cell RNA sequencing reveals the niche transitions in the non-small cell lung cancer microenvironment mediated by piR-hsa-164586 during the invasive and metastatic processes

本文首次通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合体内外实验，揭示了piR-hsa-164586在非小细胞肺癌（NSCLC）侵袭转移中的关键作用。研究发现该piRNA通过与非PIWI蛋白MYH9结合，激活PI3K-AKT通路并诱导上皮-间质转化（EMT），进而调控肿瘤微环境生态位转变。研究为以piR-hsa-164586为靶点的NSCLC分子靶向治疗提供了新策略。

　　

piR-hsa-164586在非小细胞肺癌中的异常表达与定位

前期研究发现，piR-hsa-164586在NSCLC组织和血清细胞外囊泡中异常高表达。本研究通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）证实，piR-hsa-164586在NSCLC细胞系（A549和HCC2279）中的表达水平显著高于正常肺上皮细胞（BEAS-2B）。低浓度脱氧核苷三磷酸逆转录PCR（RTL-P）分析显示，piR-hsa-164586的3′末端存在甲基化修饰，这一结构特征有助于增强其稳定性。RNA荧光原位杂交（FISH）实验进一步揭示，piR-hsa-164586同时定位于NSCLC细胞的细胞核和细胞质中，为其参与多种细胞生物学过程提供了空间基础。

piR-hsa-164586促进NSCLC细胞迁移、侵袭并抑制细胞凋亡

为探究piR-hsa-164586的功能，研究使用agomir（模拟物）和antagomir（抑制剂）分别上调和敲低piR-hsa-164586的表达，并构建了稳定过表达（OE组）、敲低（KD组）及正常对照（NC组）的细胞系。细胞功能实验结果表明，过表达piR-hsa-164586能显著促进NSCLC细胞的增殖（EdU和CCK-8实验）、迁移（划痕实验）和侵袭（Transwell实验）能力，同时抑制细胞凋亡（流式细胞术）。相反，敲低piR-hsa-164586则产生相反的效应。这些结果在体外水平证实了piR-hsa-164586对NSCLC恶性表型的促进作用。

体内实验验证piR-hsa-164586对肿瘤生长、转移及血管生成的促进作用

通过构建A549细胞裸鼠皮下移植瘤模型，研究在体内水平验证了piR-hsa-164586的致癌功能。与NC组相比，OE组肿瘤体积和重量显著增大，生长速率（TGR）更快，而KD组肿瘤生长受到抑制。免疫荧光（IF）染色显示，OE组肿瘤组织中增殖标志物Ki67的表达上调。免疫组织化学（IHC）结果显示，与肿瘤转移相关的α-SMA和与血管生成相关的CD31在OE组肿瘤组织中表达显著增加。苏木精-伊红（H&E）染色也观察到OE组肿瘤细胞核更大，提示细胞增殖更为活跃。这些体内实验数据共同证实了piR-hsa-164586在促进NSCLC生长、转移和血管生成中的关键作用。

单细胞测序揭示piR-hsa-164586通过PI3K-AKT通路影响肿瘤进展

为了深入探索piR-hsa-164586的调控机制，研究对荷瘤裸鼠的肿瘤组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。对肺腺癌上皮细胞（LUAD_ECs）的聚类分析鉴定出7个细胞亚群，其中间质亚型（Mesenchymal LUAD_EC 1和2）占比最高（61.25%）。细胞分化潜能预测（CytoTRACE）显示，间质亚型细胞处于分化晚期，具有更强的转移潜能。细胞通讯分析发现，在NC组中，增殖亚型与间质亚型细胞间的相互作用频率和强度显著高于KD组。差异表达基因（DEGs）京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析提示，PI3K-AKT通路是Mesenchymal LUAD_EC 1中最显著富集的通路之一。Western blot实验进一步验证，过表达piR-hsa-164586能提高p-AKT/AKT的比值，而敲低piR-hsa-164586则降低该比值，证实piR-hsa-164586通过激活PI3K-AKT通路促进NSCLC进展。

单细胞测序阐明piR-hsa-164586通过促进EMT调控NSCLC微环境

对肿瘤微环境（TME）的scRNA-seq分析发现，敲低piR-hsa-164586后，肿瘤组织中间质细胞比例下降而上皮细胞（ECs）比例上升。对上皮细胞和间质细胞的再聚类及伪时间轨迹分析，揭示了细胞从上皮状态经杂交间质状态向间质状态转变的动态过程，即上皮-间质转化（EMT）过程。免疫荧光染色显示，过表达piR-hsa-164586导致上皮标志物E-钙黏蛋白（Cdh1）表达下调，间质标志物N-钙黏蛋白（Cdh2）表达上调。KD组与NC组之间的DEGs进行基因本体论（GO）和KEGG分析，结果再次显著富集于EMT相关生物学过程和PI3K-AKT通路。这表明piR-hsa-164586通过调控EMT重塑NSCLC微环境，从而促进肿瘤侵袭转移。

piR-hsa-164586与MYH9相互作用共同影响NSCLC发展

为寻找与piR-hsa-164586相互作用的蛋白，研究综合运用质谱分析、RNA Pull-down、分子对接和RNA免疫共沉淀（RIP）等技术。结果发现，非肌肌球蛋白重链9（MYH9）是与piR-hsa-164586结合最显著的蛋白。RNA Pull-down和RIP实验均证实了piR-hsa-164586与MYH9的直接结合。分子对接预测两者通过11个氢键和4个盐桥紧密结合，结合能低，置信度高。功能挽救实验表明，在MYH9敲除（通过CRISPR/Cas9技术）或敲低（通过siRNA）的NSCLC细胞中，piR-hsa-164586的过表达仍能部分恢复细胞的迁移、侵袭能力以及p-AKT/AKT比值，证明MYH9是piR-hsa-164586发挥作用的下游靶点。

转录组测序揭示MYH9通过PI3K-AKT通路和EMT促进NSCLC进展

对MYH9敲低的A549和HCC2279细胞进行转录组测序，筛选出190个共同差异表达基因。KEGG通路富集分析显示这些基因显著富集于PI3K-AKT通路。GO分析则突出显示了与EMT（GO:0051607）相关的条目。临床数据分析（来自HPA和TCGA数据库）表明，MYH9在NSCLC患者肿瘤组织中高表达，且高表达与患者不良预后显著相关。此外，MYH9表达水平与EMT评分呈正相关。这些结果从转录组和临床层面证实了MYH9通过调控PI3K-AKT通路和EMT过程参与NSCLC的进展。

讨论与结论

本研究首次系统阐明了piR-hsa-164586在NSCLC侵袭转移中的功能和机制。该piRNA通过与非PIWI蛋白MYH9结合，激活PI3K-AKT信号通路并诱导EMT，从而改变肿瘤微环境生态位，最终促进NSCLC的恶性进展。单细胞测序技术的应用为在单细胞水平解析piRNA的调控网络提供了有力工具。研究成果不仅深化了对piRNA功能的理解，也为开发以piR-hsa-164586和MYH9为靶点的NSCLC分子靶向治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。