间充质干细胞来源小细胞外囊泡的分子标记物鉴定与功能相关性研究

《Interdisciplinary Medicine》：Identification of a specific marker panel for human mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles

本研究通过蛋白质组学筛选和单囊泡水平表型分析，首次系统鉴定了CD13、CD29和CD90作为脂肪、脐带和iPSC来源MSC-sEVs的高表达特异性标记物面板，其阳性率均超过60%，并能有效区分MSC-sEVs与非MSC-sEVs。研究发现CD29和CD90的表达水平与MSC-sEVs促进细胞增殖的功能活性正相关，为MSC-sEVs的质量控制和标准化应用提供了重要依据。

　　

3.1 MSC-sEVs的分离与表征

研究团队从人脂肪组织来源间充质干细胞（A-MSCs）、脐带来源间充质干细胞（U-MSCs）和人诱导多能干细胞来源间充质干细胞（i-MSCs）中分离小细胞外囊泡（sEVs），每种来源各采用三个供体的细胞系。通过差速超速离心法（dUC）从9种MSCs的条件培养基中分别分离sEVs，并依据MISEV2023指南进行表征。透射电镜图像显示所有MSC-sEVs均呈现典型的杯状形态。纳米流式细胞术（NanoFCM）检测显示其粒径分布呈不对称右偏分布，峰值约80纳米。9种MSC-sEVs的颗粒浓度和蛋白浓度存在差异，但颗粒与蛋白比值均超过1×10⁸颗粒/微克蛋白。Western Blot分析证实所有样本均表达CD9、CD63和TSG101等特征性EV蛋白，而未检测到GM130和Calnexin等阴性标志物，表明分离的sEVs符合质量标准。

3.2 通过定量蛋白质组学筛选MSC-sEVs候选标记物

为筛选候选标记物，研究团队对A-MSC-sEVs、U-MSC-sEVs和i-MSC-sEVs进行蛋白质组学分析。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定蛋白质，并分析MSC-sEVs中典型的MSCs表面抗原。结果显示，CD29、CD13、CD44、CD90、CD73、CD166和CD105在三种来源的MSC-sEVs中均高度富集，而CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19和HLA-DR等阴性表面抗原几乎检测不到或含量极低。因此，选择CD29、CD13、CD44、CD90、CD73、CD166和CD105作为有前景的候选标记物进行后续研究。

3.3 单囊泡水平鉴定MSC-sEVs标记物

为准确量化表达每个候选标记物的MSC-sEVs比例，研究团队采用先进的单囊泡流式细胞术（NanoFCM）进行分析。除MSC-sEVs候选标记物外，还评估了三种通用EV标记物（CD9、CD63、CD81）的阳性率。免疫荧光染色并去除未结合抗体后，所有样本进行NanoFCM分析。结果显示，CD9的阳性率在9种MSC-sEVs间存在差异，CD63的阳性率均在50%左右，CD81的阳性率较高（66.9±3.8%）。CD9/CD63/CD81组合染色的阳性率稳定在80%左右。在MSC-sEVs候选标记物中，CD13的阳性率在所有9种MSC-sEVs中均超过70%，平均阳性率为83.2±5.1%。CD29和CD90的阳性率均超过60%，平均阳性率分别为74.1±5.5%和70.3±4.4%。而CD44、CD73、CD105、CD146和CD166的阳性率均低于30%。此外，MSCs的阴性标记物组合在9种MSC-sEVs中几乎检测不到。综上所述，CD13、CD29和CD90在三种来源的MSC-sEVs中阳性率均超过60%，提示它们可能作为这三种MSC-sEVs的推定标记物。

3.4 验证通过DGUC和SEC分离的MSC-sEVs中的推定标记物

考虑到不同的sEVs分离方法可能导致MSC-sEVs蛋白质组成的变异，研究团队进一步采用蔗糖密度梯度超速离心（DGUC）和尺寸排阻色谱（SEC）分离MSC-sEVs，并通过NanoFCM分析验证推定标记物。结果显示，通过DGUC或SEC分离的MSC-sEVs中，通用EV标记物（CD9、CD63、CD81）和推定MSC-sEVs标记物（CD13、CD29、CD90）的阳性率与dUC分离的结果相当，表明CD13、CD29和CD90是稳定的高丰度标记物，不受sEVs分离方法的影响。

3.5 MSC-sEVs中推定标记物的高分辨率显微成像

为减少使用单一方法的潜在偏差，研究团队采用高分辨率显微成像作为正交方法，直观评估通用EV标记物（CD9、CD63、CD81）和推定MSC-sEVs标记物（CD13、CD29、CD90）的存在。首先，用绿色荧光素标记的相应抗体对MSC-sEVs进行染色，去除未结合抗体后，用膜染料（DiI）染色MSC-sEVs，然后在高分辨率显微镜下观察。获取样本图像后，利用计算机图像识别软件识别和计数紫色斑点（代表sEVs）、绿色斑点（代表相应抗体识别的标记物）和共定位斑点。共定位斑点占紫色斑点的百分比定义为这些标记物的阳性率。结果显示，MSC-sEVs中CD9（63.4±5.8%）、CD63（54.3±4.0%）、CD81（70.9±2.3%）和CD9/CD63/CD81组合（76.8±2.5%）的阳性率与NanoFCM检测结果相当。值得注意的是，推定MSC-sEVs标记物CD13（74.0±9.4%）、CD29（73.7±4.0%）和CD90（73.2±6.5%）的高阳性率与NanoFCM分析一致。两种正交方法在单囊泡水平对MSC-sEVs表型分析的结果均支持CD13、CD29和CD90作为MSC-sEVs的标记物。

3.6 推定MSC-sEVs标记物的特异性

为评估推定MSC-sEVs标记物的特异性，研究团队对六种非MSC-sEVs进行了全面的NanoFCM分析，以确定这些标记物是否能区分MSC-sEVs与非MSC-sEVs。通过dUC分离六种非MSC细胞系（HFF1、293T、A549、H460、MCF7、MDA-MB-231）来源的sEVs，并进行表征。测量九种MSC-sEVs和六种非MSC-sEVs中通用EV标记物（CD9、CD63、CD81）和推定MSC-sEVs标记物（CD13、CD29、CD90）的阳性率。结果显示，在MSC-sEVs中，这些推定标记物的阳性率均超过60%，而在非MSC-sEVs中，这些阳性率并未同时超过40%。对于通用EV标记物，CD9、CD63和CD9/CD63/CD81组合在MSC-sEVs和非MSC-sEVs之间没有明显区别，但CD81在MSC-sEVs中表现出更高的阳性率。这些发现验证了CD13、CD29和CD90在单囊泡水平识别MSC-sEVs的特异性，表明它们可以作为一个可靠的标记物面板（三个标记物阳性率阈值均>50%）来区分MSC-sEVs与非MSC-sEVs。

3.7 标记物面板与MSC-sEVs功能质量的关系

为进一步确立上述标记物的临床相关性，研究团队调查了这些标记物与MSC-sEVs功能质量之间的相关性。收集第5、7、10和12代MSCs来源的sEVs，并分别通过CCK-8实验评估其促进细胞增殖活性。结果显示，它们促进成纤维细胞（HFF1）增殖的能力逐渐降低，表明MSC-sEVs的功能随传代次数增加而下降。CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105在连续传代MSCs中的阳性率相对稳定。随后，评估sEVs中上述标记物的阳性率。结果显示，MSC-sEVs中CD29和CD90的阳性率随MSCs传代逐渐降低，在第12代时降至50%以下，而CD13的阳性率始终保持在80%左右。这些发现表明，CD29和CD90的阳性率可能预测MSC-sEVs的功能质量。