定制弧菌型分泌素通道蛋白GspD构建“一步到位”双收缩纳米孔传感器

《Small》：Tailoring Vibrio-Type Secretin Channel Protein GspD Toward “One-Take” Dual-Constriction Nanopore Sensors

本研究针对现有双收缩纳米孔复合物（如CsgG-CsgF）在高电压下易解离的问题，由研究人员开展对霍乱弧菌II型分泌素蛋白D（VcGspD）的工程化改造。研究通过截断N0-N2结构域实现稳定多聚化，利用冷冻电镜解析15聚体结构，并通过S346C突变联合胆固醇-马来酰亚胺修饰实现脂质双层稳定嵌入。电生理表征证实其具备≈2 nm双收缩结构，F472A突变赋予高电压稳定性，成功实现单链DNA和多肽的高效检测。该工作为分泌素通道的纳米孔传感开发提供了创新平台。

　　

双收缩纳米孔通过引入第二个传感区域，可显著增强单分子水平分析物的相互作用。然而现有生物纳米孔复合物（如CsgG-CsgF）在高电压下易发生解离，亟需开发稳健的"一步到位"平台。本研究提出并改造了霍乱弧菌（Vibrio cholerae）II型通用分泌素蛋白D（VcGspD）作为具有双收缩结构的新型支架。生化分析表明，截断N0-N2结构域能形成稳定多聚体，其中N3结构域至关重要。冷冻电镜（Cryo-EM）解析显示截短版VcGspD（N0-N2）形成15聚体结构，证实其结构完整性并精确定位P471和F472残基。通过在346位点引入点突变（S346C）并偶联胆固醇-马来酰亚胺，成功实现通道在脂质双层的稳定嵌入。电生理表征揭示该通道主要呈现低电导的双收缩架构，帽状结构和中心收缩位点的直径均约为2纳米。F472A突变与两个收缩位点的联合改造使开放通道电流趋于一致，并赋予高电压稳定性，从而实现对单链DNA和多肽的高效传感。该研究确立了VcGspD作为双收缩纳米孔传感平台的潜力，为分泌素通道的开发与工程化应用开辟了新路径。