微孔蛋白结器件：生物电子学的稳健平台

《Small》：Hard-Wired Solid-State Bioelectronic Micropore Devices: Permanent Metal-Protein-Metal Junction Proof-of-Concept

本文综述了微孔蛋白结器件（MpD）作为一种可靠的固态生物电子学平台，其通过受控蒸发金属顶电极实现了稳定的电子传输测量。文章重点阐述了MpD的精密制造工艺（涉及光刻、原子层沉积（ALD）和电子束蒸发）、功能化策略（适用于球状蛋白如人血清白蛋白（HSA）和膜蛋白如细菌视紫红质（bR）），并通过阻抗谱、电流-电压（I-V）特性、光循环活性和光弹性调制红外反射吸收光谱（PEM-IRRAS）验证了器件中蛋白质的结构与功能完整性。该平台解决了接触电阻、短路和生物分子变性等关键挑战，为研究蛋白质电子传输机制和在传感器、存储器等生物电子器件中的应用提供了新途径。

　　

微孔蛋白结器件（MpD）的构建与表征

固态蛋白结是研究生物分子电子传输和开发生物电子器件的关键平台。然而，制备具有稳定电接触且能保持蛋白质天然构象和功能的固态器件面临巨大挑战。微孔器件（MpD）配置通过精密的微加工技术，提供了一个受控的环境来研究蛋白质层的电子传输特性。本文详细介绍了MpD的制造流程、功能化策略、电学表征方法，并验证了其在顶电极蒸发后仍能保持蛋白质的结构完整性和功能活性，证明了其作为研究蛋白质电子传输和生物电子应用平台的稳健性。

MpD器件的设计与制造

MpD的核心结构是在绝缘衬底上制备的金属-绝缘体-金属（MIM）结。制造过程始于在热氧化硅片上通过光刻和电子束蒸发定义底部金电极阵列。关键步骤是使用原子层沉积（ALD）在整個芯片上覆盖一层均匀、无针孔、约20纳米厚的氧化铝（Al₂O₃）绝缘层。随后，通过第二次光刻和反应离子刻蚀（RIE）在氧化铝层上于每个底部电极中心位置创建微米级孔洞（约20平方微米），暴露下方的金电极表面。这种设计确保了结面积的精确界定，并将边缘效应和电流泄漏降至最低。微孔的尺寸经过优化，以在蛋白质覆盖度和防止顶电极沉积过程中形成短路之间取得平衡。

蛋白质层的功能化

在微孔制造完成后，接下来是蛋白质层的组装。研究选用了两种模型蛋白：球状蛋白人血清白蛋白（HSA）和膜蛋白细菌视紫红质（bR）。对于HSA，其通过天然的半胱氨酸残基与金电极形成金-硫键直接固定。对于bR，首先在金电极上自组装一层胱胺连接分子，然后通过静电相互作用吸附第一层bR。随后，通过碳二亚胺（EDC）介导的酰胺键形成，逐层共价连接额外的蛋白质层，形成均匀的多层蛋白质薄膜。原子力显微镜（AFM）刮擦实验证实了蛋白质层的厚度，例如HSA四层约为16±1纳米，bR三层双层约为22±2纳米。

顶电极的沉积与器件完整性

MpD的一个显著特点是使用蒸发沉积的金属（钯（Pd），随后覆盖金（Au））作为顶电极。为了最大限度地减少蒸发过程对蛋白质层的潜在损伤，采用了特定的保护措施：样品台冷却至18°C、高真空环境（<10^-7 Torr）、倾斜角度的半间接蒸发以及使用相对低能的电子枪。这些条件有助于保护蛋白质的完整性并防止电气短路。

电学表征与功能验证

器件的电学表征包括直流（DC）电流-电压（I-V）测量和交流（AC）阻抗谱分析。阻抗谱，特别是波特图中的相位响应，被用作筛选功能性（非短路）结的关键诊断工具。在高质量蛋白质结中，高频（约10 kHz以上）时阻抗相位角接近90°，表明其具有理想的电容行为，电流主要通过蛋白质介电层，而非经由金属细丝泄漏。短路或部分短路的结则显示出明显更低的相位角。只有那些通过阻抗验证的结才用于进一步的电子传输研究。

直流测量结果显示，HSA和bR结的电流密度存在明显差异，且均比短路结的电流低6-8个数量级。值得注意的是，尽管bR层更厚，但其结电流却高于HSA层，这与之前一些研究结果一致，表明电子传输效率不仅取决于厚度，还与蛋白质的固有结构和电子耦合有关。

稳定性和功能性是关键考量因素。MpD结表现出卓越的稳定性，部分结的I-V特性在一个月后仍无明显变化。此外，这些结能够承受从室温（293 K）到低温（10 K）的热循环，其电流响应仅发生微小变化，显示出近乎无温度依赖性的电子传输行为，这对于理解传输机制提出了挑战。

为了验证顶电极蒸发后蛋白质的功能完整性，研究人员进行了两项关键实验。对于光活性蛋白bR，构建了具有光学透明顶电极（7纳米Pd）的结，并观察到了其典型的光循环：在黄光照射下，出现了表征M中间体的410纳米吸收峰，表明bR的视网膜发色团和蛋白质构象变化得以保留。对于更通用的蛋白质结构完整性评估，采用了光弹性调制红外反射吸收光谱（PEM-IRRAS）。结果表明，在蒸发7纳米Pd层之后，HSA和bR薄膜的酰胺I带（≈1670 cm^-1）和酰胺II带（≈1550 cm^-1）的特征吸收峰位置和形状没有发生显著变化，证明受控的Pd沉积不会破坏蛋白质的二级结构。

MpD平台的优势与局限

MpD配置的主要优势在于其坚固性、确定的结几何形状、可忽略的接触电阻以及与低温测量和实验室间转移的兼容性。它支持多种蛋白质固定策略，适用于研究不同类型的生物分子。

然而，该平台也存在一些局限性。例如，要获得无短路的功能结，需要非常致密的蛋白质覆盖层（通常需要多层）。此外，由于结的活性区域（蛋白质覆盖的微孔）远小于顶电极与周围氧化铝绝缘层接触的总面积，阻抗测量主要反映氧化铝的介电特性，无法用于精确测定单个结中蛋白质层的厚度变化。另外，当前基于硅衬底和不透明顶电极的器件几何结构阻碍了直接的光电流测量，需要通过构建辅助的透明结结构来评估光活性。

结论

微孔蛋白结器件（MpD）通过精密的微加工和受控的顶电极集成，成功构建了一个结构坚固、电学稳定且能保持蛋白质功能活性的固态生物分子电子学平台。其对蛋白质结构完整性和功能活性的保留，以及展现出的独特电子传输特性（如弱温度依赖性），使其成为深入研究蛋白质电子传输基本机制和开发下一代生物电子应用（如传感器、存储器和生物-半导体接口）的强大工具。