iNKT细胞在肝细胞癌发生发展中的双重作用机制研究

《Communications Biology》：Dual regulatory role of natural killer T cells during development of hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌(HCC)免疫微环境中iNKT细胞功能不明确的科学问题，通过DEN诱导的小鼠HCC模型，结合CD1d-/-和Vα14Tg/+基因修饰小鼠，发现iNKT细胞在HCC早期通过促进炎症反应加速肿瘤发生，而在肿瘤形成后则通过抑制Treg细胞和改善免疫抑制微环境抑制肿瘤进展。该研究为iNKT细胞在HCC中的时相特异性功能提供了新见解，对HCC免疫治疗策略开发具有重要意义。

　　

在肝细胞癌(HCC)这种全球范围内发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤中，免疫微环境的调控机制一直是研究热点。尽管免疫检查点抑制剂等免疫治疗方法在某些HCC患者中显示出疗效，但总体响应率仍不理想，这促使科学家们深入探索肿瘤微环境中各种免疫细胞亚群的功能特性。在肝脏这一特殊免疫器官中，存在一群独特的固有样T细胞——不变自然杀伤T细胞(iNKT细胞)，它们同时表达T细胞受体(TCR)和自然杀伤细胞(NK细胞)受体，能够识别CD1d分子提呈的脂质抗原，并在免疫调节和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

然而，iNKT细胞在HCC发生发展过程中的具体作用一直存在争议。有些研究表明iNKT细胞具有抗肿瘤活性，而另一些研究则提示它们可能促进肿瘤发展。这种矛盾可能源于iNKT细胞功能的高度环境依赖性，以及它们在肿瘤发生不同阶段可能扮演不同角色。为了解决这一科学问题，研究人员在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果，系统揭示了iNKT细胞在HCC中的双重作用。

为了探究iNKT细胞在HCC中的作用机制，研究团队采用了多学科交叉的研究方法。他们主要使用了DEN诱导的小鼠HCC模型，这是一种经典的化学诱导肝癌模型，能够模拟人类HCC的多阶段发生过程。研究人员还利用了CD1d^-/-基因敲除小鼠(缺乏iNKT细胞和II型NKT细胞)和Vα14^Tg/+转基因小鼠(iNKT细胞过表达)，通过比较这些基因修饰小鼠与野生型小鼠在HCC发生发展过程中的差异，来阐明iNKT细胞的具体功能。关键技术手段包括流式细胞术分析免疫细胞组成和功能、组织病理学分析、RNA测序分析iNKT细胞转录组特征、过继性细胞转移实验以及血清生化指标检测等。

HCC微环境中iNKT细胞数量减少且功能受损

研究人员首先发现，在DEN诱导的HCC小鼠肝脏中，iNKT细胞的数量显著减少，而常规T细胞和巨噬细胞的数量增加。通过CD1d四聚体染色和Vα14 Jα18转录本分析均证实了iNKT细胞的减少。更有趣的是，肿瘤组织内的iNKT细胞数量比癌旁正常组织更少，且iNKT细胞频率与肿瘤数量呈负相关，提示iNKT细胞可能在肿瘤控制中发挥有益作用。

功能分析显示，HCC环境中的iNKT细胞表现出激活受损(CD69表达降低)、耗竭增加(PD1表达升高)以及细胞因子产生能力和脱颗粒功能下降。尽管PMA/ION刺激后产生IFNγ和TNFα的iNKT细胞百分比无显著变化，但每个细胞产生的细胞因子量明显减少，CD107a表达也降低，表明其功能严重受损。

HCC微环境诱导iNKT细胞凋亡

转录组分析揭示，HCC来源的iNKT细胞中有156个基因表达发生显著改变，其中111个基因上调，45个基因下调。基因本体分析显示，上调基因富集在与细胞死亡和生物合成过程受损相关的通路中。流式细胞术检测进一步证实，HCC小鼠iNKT细胞中活化的caspase 3表达增加，表明这些细胞正在发生凋亡，这可能是其在肿瘤微环境中数量减少的重要原因。

过继转移iNKT细胞抑制肝癌发展

研究人员通过过继转移实验探讨了补充iNKT细胞对HCC的治疗潜力。他们发现，在DEN处理后6个月(肿瘤已建立阶段)输注健康来源的iNKT细胞，能够显著减少肿瘤病灶数量和体积，而在早期(1或3个月)输注则无此效果。重要的是，iNKT细胞治疗还降低了调节性T细胞(Treg细胞)的频率，改善了肿瘤免疫微环境。这表明iNKT细胞在肿瘤已建立阶段具有抑制肿瘤进展的作用。

CD1d缺陷小鼠肿瘤负荷减轻但免疫抑制增强

令人意外的是，CD1d^-/-小鼠在DEN处理后发展的肿瘤和癌前病灶数量显著少于野生型小鼠，但肿瘤体积更大。这些肿瘤表现出更高的增殖活性(Ki67和c-Jun表达增加)，且肿瘤微环境更具免疫抑制性(Il4和Il10表达升高，Il6表达降低，Treg/T细胞比率增加)。这表明NKT细胞的缺失虽然减少了肿瘤发生，但一旦肿瘤形成，则会创造更有利于肿瘤生长的环境。

iNKT细胞促进HCC的发生

通过在不同时间点分析HCC发展过程，研究人员发现CD1d^-/-小鼠的癌前病变和肿瘤出现时间晚于野生型小鼠，而Vα14^Tg/+小鼠则在早期表现出更多的癌前病变。这表明iNKT细胞在HCC起始阶段发挥促进作用，加速了肿瘤的发生。

iNKT细胞参与DEN诱导的肝损伤过程

在DEN处理的急性期(48小时)，iNKT细胞被激活(CD69表达增加)，而CD1d^-/-小鼠表现出较轻的肝损伤(ALT和AST水平较低)和炎症反应(Il1β、Il6和Tnfα表达降低)，中性粒细胞浸润减少，Treg细胞数量和活性增加。相反，Vα14^Tg/+小鼠肝损伤更严重，Treg细胞应答较弱。这表明iNKT细胞在HCC起始阶段通过促进炎症和肝损伤，为肿瘤发生创造了有利条件。

本研究系统阐明了iNKT细胞在HCC中的双重作用：在肿瘤起始阶段，iNKT细胞通过促进炎症反应和肝损伤，加速肿瘤发生；而在肿瘤建立后，iNKT细胞则通过抑制Treg细胞和改善免疫抑制微环境来抑制肿瘤进展。这一发现不仅解决了关于iNKT细胞在HCC中作用的长久争议，还为HCC的免疫治疗提供了重要启示：针对iNKT细胞的治疗策略需要考虑疾病的不同阶段，早期抑制iNKT细胞活性可能预防肿瘤发生，而后期增强iNKT细胞功能则可能抑制肿瘤发展。该研究为开发时相特异性的HCC免疫治疗策略奠定了理论基础，具有重要的临床转化价值。