内质网蛋白质合成过程中转位子重塑的全局分析揭示底物驱动的分子逻辑

《Nature Structural & Molecular Biology》：Global analysis of translocon remodeling during protein synthesis at the ER

本刊编辑推荐：这项研究通过选择性核糖体分析技术（selective ribosome profiling）在人类细胞中全局性地解析了内质网（ER）蛋白质合成过程中N-糖基化（OST-A复合物）和多跨膜膜蛋白合成（GEL、PAT和BOS复合物，统称为MPT）辅助因子与核心Sec61转位通道的动态相互作用。研究揭示了底物驱动转位子重塑的分子逻辑：OST-A优先招募至开放构象的Sec61通道进行长片段多肽转运，而MPT则同步招募至关闭的Sec61通道并被新插入的跨膜结构域（TMD）稳定。该发现对于理解分泌蛋白和膜蛋白的高效生物发生至关重要。

　　

选择性核糖体分析鉴定OST-A和MPT的共翻译客户

为了全局定义OST-A、GEL、PAT和BOS复合物的共翻译相互作用，研究人员采用了一种近期描述的、针对低输入样本优化的核糖体分析方法。他们构建了稳定整合的HEK293细胞系，这些细胞系表达接近内源水平的Flag标记的OST-A亚基以及GEL、PAT和BOS复合物的亚基。从总膜组分和亲和纯化组分中制备核糖体保护的mRNA片段，并对每个细胞系进行生物学重复测序。通过比较分析两组数据集计算每个样本的富集比率，并使用DeepTMHMM对蛋白质进行注释。最终获得的高质量数据能够识别每个因子的天然客户及其相应的结合位点。

OST48和RPN2的转录本富集高度相关，这与它们属于同一复合物的亚基相符，因此将其合并为一个样本，称为“OST-A”。在合并数据集中检测到的约4,703种蛋白质中，最富集的是具有长易位片段的蛋白质，包括含有信号肽的可溶性分泌蛋白、I型和II型单次跨膜蛋白以及I型多次跨膜蛋白。尽管GEL、PAT和BOS复合物在缺乏核糖体时彼此不相互作用，但它们的转录本富集和相互作用谱高度相关，因此将其合并为一个样本，称为多次跨膜转位子。在合并的MPT数据集中检测到的约7,763种蛋白质中，最富集的是具有两个或更多TMD的膜蛋白，包括I型、II型和III型多次跨膜蛋白。

转录本富集与不同底物蛋白类别的拓扑特性相关性，与OST-A和MPT分别在共翻译N-糖基化和多次跨膜膜蛋白生物发生中提出的作用一致。OST-A富集的底物类别至少有一个长于约100个氨基酸的易位结构域，该结构域通过与其相关的Sec61通道。相反，MPT特异性富集多次跨膜膜蛋白，而细胞核蛋白、可溶性分泌蛋白和大多数单次跨膜膜蛋白未被富集。

OST-A在长片段易位过程中与转位子结合

与这些拓扑相关性一致，对单个相互作用谱的分析表明，OST-A在长片段易位过程中被选择性招募。一个例子是Neogenin，这是一种I型单次跨膜细胞表面受体，具有八个预测的N-糖基化接受序列，在其约1,000个残基的胞外结构域易位过程中招募OST-A。对可溶性和I型单次跨膜蛋白的Metagene分析显示，当信号肽末端与肽基转移酶中心的P位点tRNA之间有约90个残基时，OST开始到达转位子。对于II型单次跨膜蛋白观察到类似但更渐进的到达。在此点之前，即使核糖体-新生链复合物被认为在第一个靶向信号后仅合成约30-40个残基时就已到达膜，但检测到很少的OST-A结合。

假设约55个残基埋在核糖体出口隧道和Sec61通道中，则当约35个残基进入腔内时，OST-A开始结合，并随着易位的继续而逐渐稳定。在这些长度下，新生链足够长，可以采样STT3A活性位点以进行接受序列的N-糖基化。值得注意的是，在接近最大OST-A招募的点，当约80个残基的新生链进入腔内时，几乎一半的所有可溶性、I型和II型单次跨膜蛋白的第一个接受位点要么尚未合成，要么仍埋在核糖体出口隧道或Sec61通道中。这表明OST-A的招募对接受序列的存在不敏感。与此一致的是，具有长易位片段的可溶性、I型和II型单次跨膜蛋白的富集，无论是否含有接受序列，几乎相同。

一旦被招募到C端完全易位跨膜的可溶性和II型单次跨膜蛋白上，OST-A始终保持结合，直到翻译终止。相反，在C端位于胞质的I型单次跨膜蛋白合成过程中，OST-A的离开与TMD从核糖体中出现相一致。该TMD通过Sec61侧向门通道终止新生链易位并关闭通道，此时OST-A从转位子上解离。

这些数据共同表明，OST-A不是预组装的转位子组分，而是在通过开放Sec61通道的长片段易位过程中被招募的。虽然使用体外制备的III型底物的停滞单TMD中间体观察到OST-A与关闭的Sec61相邻，但对ER膜中天然分泌转位子的冷冻电子断层扫描分析显示OST-A与开放的Sec61结合。关键的结构开关可能涉及Sec61插塞螺旋从通道中心的位移，这使其能够与Sec61α铰链、Sec61γ和OST-A的DC2亚基的部分相互作用。新生链与OST-A活性位点直接接触的贡献可能很小，因为新生链扫描必然是动态的。因此，OST-A结合对Sec61的构象敏感——在通过开放通道的长片段易位过程中有利，而在通道关闭时不利。

关闭Sec61通道处的同步MPT动力学

GEL、PAT和BOS复合物可以与核糖体和Sec61共纯化，但在缺乏核糖体时彼此不显著相互作用。然而，对编码约2,000种单次和多次跨膜膜蛋白的转录本富集比较显示，三个样本之间存在强相关性，表明GEL、PAT和BOS复合物作用于一组相似的客户。

位置分析显示，GEL、PAT和BOS复合物的招募动力学也是相关的，尽管它们在转位子处仅有限地相互接触。一个例子是C-X-C趋化因子受体4型，这是一种具有七个由短亲水片段连接的TMD的III型G蛋白偶联受体，在其整个长度上显示出几乎相同的相互作用谱。在数百种多次跨膜蛋白中观察到类似的行为，如三个复合物的谱峰之间的强相关性所示。这与先前对停滞和截短的多次跨膜膜蛋白中间体的体外研究一致。

早期的体外研究表明，当具有足够长系链到一个或多个TMD进入膜时，GEL、PAT和BOS复合物的招募开始。对第一个易位片段短的多跨膜蛋白的Metagene分析显示，在第一个TMD或紧密间隔的TMD对从核糖体中出现后，MPT结合逐渐稳定。相反，对于第一个易位片段长的多跨膜蛋白，最大MPT结合被延迟。如下文所述，这是由于通过开放Sec61的新生链易位，不利于早期MPT结合。随着进一步延伸，当下游TMD通过Sec61侧向门时，易位终止。这关闭了通道并逐渐稳定了MPT，后者现在可以结合膜中的底物TMD。

下游腔区和胞质区短的多跨膜客户在翻译完成前一直与MPT保持结合，无论下游TMD的数量如何。这方面的例子包括DOLK、RFT1、SLC7A11和MFSD3。值得注意的是，位于MPT中心的部分封闭的脂质填充腔的容量估计为约6-8个TMD。这表明大型多跨膜蛋白的TMD可以在合成过程中移出中央腔，而不会破坏MPT结合。

多次跨膜蛋白合成过程中OST-A和MPT的相互作用

在OST-A和MPT输入样本中检测到的866个多次跨膜编码转录本中，约511个仅通过MPT亲和纯化富集。这些几乎全部编码最长易位片段短的蛋白质。相反，大多数被OST-A和MPT均富集的约268个多次跨膜编码转录本被发现含有至少一个长的易位片段。这些底物需要在长片段易位过程中保持Sec61通道开放。

对OST-A和MPT均富集的转录本进行位置分析，揭示了取决于长易位片段位置的不同招募模式。第一个易位片段长的多次跨膜蛋白，包括I型和部分II型蛋白，早期招募OST-A，而第一个易位片段短的则较晚招募OST-A。重要的是，OST-A和MPT峰之间几乎没有重叠，这与它们相互排斥地结合转位子一致。

为了更详细地分析OST-A和MPT交换的早期动力学，我们比较了第一个易位片段长的I型和II型多次跨膜蛋白的Metagene谱。当信号肽或第一个TMD打开Sec61以启动易位时，对关闭Sec61通道的初始MPT采样被打断。随后，与在I型单次跨膜蛋白中观察到的动力学相似，当信号肽或第一个TMD末端与P位点tRNA之间有约90个残基时，OST-A招募开始，并持续到易位被侧翼TMD的插入终止。此时，OST-A离开，MPT在推测关闭的Sec61处稳定下来。

一旦MPT完全结合，其持续结合取决于新生链的下游特征。如上所述，下游腔区和胞质区短的多跨膜客户在翻译完成前一直与MPT保持结合。相反，长下游腔区的合成导致MPT解离，并在新生链通过Sec61易位时逐渐招募OST-A。一个显著的例子是尼曼-匹克病C型细胞内胆固醇转运蛋白1。这种高度糖化的1,278个残基的II型蛋白包含13个TMD和三个长的约250个残基的腔区。这些片段在整个NPC1合成过程中驱动多个OST-A和MPT结合和解离循环。

长下游胞质区的合成也破坏了MPT结合。这由HMG-CoA还原酶说明，其在八个TMD合成过程中结合MPT，然后在一个长的胞质C尾上解离，以及SERCA2泵，其在TMD合成过程中交替结合MPT并在两个长的内部胞质环上解离。值得注意的是，由于这些胞质片段不打开Sec61通道，因此未观察到OST-A结合。

长腔区和胞质区的不同组合产生不同的招募模式。一个显著的例子是Piezo1，这是Piezo1机械敏感通道的2,521个残基的孔形成亚基，包含38个TMD、长的胞质和腔区结构域以及几个N-糖基化接受位点。MPT在紧密间隔的TMD合成期间结合Piezo1，并在长胞质和腔区片段上解离。相反，OST-A在最后两个Piezo1 TMD之间的164个残基腔区片段易位期间被招募，但在MPT在长胞质片段上解离时则不被招募。

Sec61是长亲水片段易位所必需的

底物富集和核糖体分析表明，OST-A优先招募到开放的核糖体结合Sec61通道，MPT优先有利于结合关闭的Sec61通道，并且这两个复合物是互斥的。此外，没有任何长易位结构域的蛋白质从不稳定地将OST-A招募到核糖体-Sec61复合物，但在多次跨膜膜蛋白的情况下，会招募并保留MPT。这些全转录组的发现与最近提出的膜蛋白插入模型一致，其中Sec61打开仅需要用于长片段的易位，而Oxa1插入酶用于短片段的易位。该模型的一个强预测是，不需要Sec61打开的底物类别将对小分子Sec61侧向门抑制剂完全无反应，该抑制剂将Sec61锁定在关闭构型。

为了在细胞中测试该模型，研究人员使用了一种双色比率测定法来监测每类分泌和膜蛋白报告分子对Apratoxin A的敏感性，Apratoxin A是一种有效的Sec61侧向门小分子抑制剂。急性抑制Sec61降低了每种含有至少一个长易位片段的底物的稳定性。这包括含有信号肽的分泌蛋白、I型单次跨膜和多次跨膜膜蛋白、II型单次跨膜膜蛋白以及其中一个下游易位环长的III型多次跨膜蛋白。相反，ApraA对仅由短易位片段组成的底物影响很小，包括单次III型和尾锚定膜蛋白，以及没有长易位结构域的II型和III型多次跨膜蛋白。

对ApraA的敏感性可直接归因于易位片段的长度，因为当引入长易位片段时，对ApraA不敏感的多跨膜蛋白变得敏感。相反，当长的易位片段缩短时，敏感的多跨膜蛋白变得对抑制不敏感。这一结果很重要，因为它表明TMD的特征（在所有这些构建体中保持不变）并不决定其插入是否通过Sec61侧向门。而是下游易位片段的长度决定了前面的TMD是否会打开Sec61通道。这些数据与早期的抑制剂研究一致，并支持新生链在Oxa1插入酶和Sec61之间分流的模型。

讨论

研究人员分析了ER蛋白质易位 machinery 在接近密码子分辨率下，在分泌和膜蛋白质组生物发生过程中的组成。结果提供了关于蛋白质糖基化和膜插入因子如何以及何时与核心Sec61易位通道结合和解离的全面视图。研究结果提出了几个概念。

首先，OST-A优先结合 actively translocating soluble protein domains（无论是否含有N-糖基化接受序列）进入ER腔的开放Sec61通道。其机制可能围绕Sec61插塞展开，插塞在通道打开过程中发生位移，以稳定涉及Sec61α铰链、Sec61γ和OST-A的DC2亚基的相互作用网络。当易位完成且Sec61通道关闭时，该界面被破坏，OST-A结合变得不利。

其次，MPT优先结合在多次跨膜膜蛋白合成过程中的关闭Sec61通道。招募在早期阶段开始，并随着TMD插入膜中而逐渐稳定。一旦结合，MPT在紧密间隔的TMD合成期间持续存在，但在长腔区片段上解离，可能是由于PAT复合物闩锁螺旋与开放Sec61的冲突。MPT在长胞质片段上也会解离。其机制尚不清楚，但可能反映了新生多肽在核糖体-转位子连接处有限空间内的积累。

第三，许多多次跨膜蛋白的合成不需要打开Sec61通道。虽然随后有长易位片段的TMD插入需要Sec61，但随后有短易位片段的TMD可以通过MPT插入。因此，数百种只有短易位片段的多次跨膜蛋白的生物发生可以在不打开Sec61通道或结合OST-A的情况下发生。

第四，在复杂多结构域膜蛋白的合成过程中，转位子组成可以重复且可逆地变化。以人类细胞中平均5-10个氨基酸每秒的延伸速率计算，合成一个典型的350个残基的多次跨膜蛋白大约需要一分钟。这比膜内蛋白质-蛋白质相遇的毫秒时间尺度慢得多。因此，在细胞中观察到的广泛转位子重塑，特别是在结构复杂的多次跨膜蛋白合成过程中，在物理上是合理的。

综上所述，数据揭示了新生多肽如何驱动Sec61的构象变化，从而调节转位子的组成。尽管可能存在例外，但这些一般原则可以广泛外推到人类分泌和膜蛋白质组的全部多样性。

没有长易位片段的II型多次跨膜蛋白对ApraA不敏感这一观察结果是出乎意料的，因为先前的工作表明，源自这些蛋白质的停滞单TMD中间体可以在体外结合分泌转位子。与抑制剂数据一致，分析显示在细胞中没有早期OST-A招募的证据。连接大多数II型多次跨膜蛋白第一个TMD对的短片段易位可能涉及MPT（其在第二个TMD从核糖体出现之前就开始采样关闭的Sec61通道）或EMC（其可以共翻译易位III型多次跨膜蛋白的短腔区N尾）。

数据还提出了关于当部分合成的多次跨膜蛋白的已插入TMD未被隔离在MPT中央腔内时如何被陪伴的问题。这可能发生在不同背景下，包括在合成具有许多TMD的多次跨膜蛋白过程中，或当MPT在长胞质或腔区片段合成过程中（至少暂时地）从转位子解离时。这些暴露的底物TMD推测会被一般的或客户特异性的膜内陪伴蛋白屏蔽，例如EMC、Nacho或其他因子。一个重要的未来目标是识别相关的陪伴蛋白，并定义它们在多次跨膜蛋白合成过程中如何与转位子协调。