依达拉奉共轭A2A受体拮抗剂P686通过双重靶向机制促进少突胶质细胞分化和髓鞘再生

《Neuropharmacology》：Adenosine A 2A Receptor blockade promotes oligodendrocyte differentiation and myelination: Highlighting the Potency of an Edaravone-Conjugated A 2A Receptor Antagonist

本研究针对脱髓鞘疾病中少突胶质前体细胞（OPC）分化受损和氧化应激双重病理机制，开发了新型依达拉奉共轭A2A受体拮抗剂P686。研究发现，A2A受体拮抗可促进OPC分化并抵抗氧化损伤，而P686在OPC/背根神经节神经元共培养模型中显著增强髓鞘形成，为多靶点治疗脱髓鞘疾病提供了新策略。

　　

在神经科学领域，髓鞘作为包裹神经轴突的脂质绝缘层，对于神经冲动的快速传导至关重要。少突胶质细胞是中枢神经系统中负责髓鞘形成的关键细胞，其功能障碍导致的髓鞘丢失是多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）和肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）等脱髓鞘疾病的共同特征。当前治疗策略主要针对单一病理环节，如抗氧化应激，但脱髓鞘疾病涉及复杂的多机制损伤过程，开发能够同时干预多个病理环节的多靶点药物成为迫切需求。

腺苷作为一种内源性神经调质，通过其G蛋白偶联受体（A₁R、A_2AR、A_2BR和A₃R）发挥广泛生理作用。其中，A_2A受体（A_2AR）在少突胶质细胞发育各阶段均有表达，并参与调节其分化成熟过程。研究表明，A_2AR的激活会抑制少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte Precursor Cells, OPCs）的电压依赖性钾电流，从而延迟其分化。而在多发性硬化患者和实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE）小鼠模型中，A_2AR表达上调与疾病严重程度相关。有趣的是，A_2AR在脱髓鞘疾病中扮演着双重角色：疾病早期激活具有抗炎作用，而症状出现后阻断则有助于防止脱髓鞘和微胶质细胞活化。

另一方面，氧化应激是神经退行性病变的另一关键因素。依达拉奉（Edaravone）作为一种自由基清除剂，已获美国FDA批准用于ALS治疗，在日本也广泛应用于急性缺血性卒中。它不仅能清除活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），还能激活核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2, NRF2）通路，调节解毒和ROS稳态相关基因表达，并抑制促炎细胞因子释放。研究表明，依达拉奉能促进多种体外和体内模型中的髓鞘再生。

基于以上背景，意大利佛罗伦萨大学的研究团队在《Neuropharmacology》上发表了一项创新性研究，他们设计并合成了一种新型杂交化合物P686，将噻唑并嘧啶类A_2AR拮抗剂P400与依达拉奉通过化学连接子结合，旨在同时靶向A_2AR信号通路和氧化应激途径。研究假设这种双重靶向策略可能比单一靶点干预更有效地促进少突胶质细胞分化和髓鞘形成。

为验证这一假设，研究人员综合运用了全细胞膜片钳记录、抗氧化活性测定、定量实时聚合酶链反应（Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR）以及OPC与背根神经节神经元（Dorsal Root Ganglion Neuron, DRGN）共培养等多种技术方法。研究使用Wistar大鼠来源的原代细胞进行体外实验，包括纯化的OPC培养物和OPC/DRGN共培养体系，关键实验技术涵盖电生理学、分子生物学和免疫荧光染色等。

3.1. 选择性A_2AR激活抑制培养OPCs中的电压依赖性K⁺电流，该效应可被噻唑并嘧啶类A_2AR拮抗剂阻止

电生理学结果显示，选择性A_2AR激动剂CGS21680（100 nM）以及内源性配体腺苷（100 nM）均能可逆地抑制OPCs中由电压斜坡协议（从-120 mV到+80 mV）引发的外向钾电流，特别是延迟整流钾电流（I_K）成分，而对瞬时钾电流（I_A）无影响。这种抑制效应可被经典的A_2AR拮抗剂SCH58261以及研究团队合成的噻唑并嘧啶类拮抗剂P625、P400有效阻止。新合成的杂交化合物P686同样能显著拮抗腺苷引起的钾电流抑制，表明与依达拉奉的共轭并未影响其A_2AR拮抗活性。浓度效应曲线显示P625的IC₅₀为2.30 nM，表明其具有高功能效力。单独应用依达拉奉（0.1-1 μM）对钾电流无显著影响。

3.2. A_2AR拮抗剂和依达拉奉共轭衍生物P686增加了纯化培养OPCs中的细胞分化并阻止了H₂O₂诱导的ROS水平升高

在分化条件下培养5天后，通过qRT-PCR检测髓鞘相关基因表达。结果显示，A_2AR拮抗剂P625和杂交化合物P686能显著上调髓鞘相关糖蛋白（Myelin-Associated Glycoprotein, MAG）和髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）的mRNA水平，而依达拉奉单独应用则无此效应。在抗氧化实验中，所有测试的化合物（包括SCH58261、P625、P686和依达拉奉）预处理均能显著减轻300 μM H₂O₂引起的ROS水平升高，提示A_2AR拮抗剂本身可能具有一定的抗氧化特性。

3.3. 依达拉奉共轭衍生物P686增加了DRGN/OPC共培养中的髓鞘形成

在更能模拟体内髓鞘形成环境的OPC/DRGN共培养模型中，通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析评估髓鞘形成。量化指标包括MBP表达总量以及反映MBP阳性像素与神经元标记物βIII-微管蛋白（βIII-tubulin）阳性像素重叠程度的Manders系数（M1）。尽管所有A_2AR拮抗剂均显示出促进OPC分化的潜力，但唯有杂交化合物P686处理能显著提高M1系数，表明其能有效增强髓鞘形成。而单独使用依达拉奉或SCH58261等拮抗剂则未观察到对髓鞘形成的显著促进作用。

研究结论与讨论部分指出，该研究为少突胶质细胞分化和髓鞘形成的体外调控机制提供了新的见解。A_2AR拮抗剂通过阻断腺苷对OPC钾电流（特别是I_K）的抑制，从而促进其分化。同时，这些化合物以及依达拉奉均表现出抵抗氧化应激损伤的能力。然而，最关键的发现在于，只有兼具A_2AR拮抗和抗氧化活性的双靶点杂交化合物P686，才能在OPC/DRGN共培养模型中有效促进髓鞘形成。这表明，在脱髓鞘疾病的复杂病理环境中，同时干预受体信号通路和氧化应激可能产生协同或叠加效应，从而更有效地支持髓鞘再生过程。

这项研究的意义在于，它不仅证实了A_2AR作为促进髓鞘再生潜在靶点的价值，更重要的是提出并验证了一种创新的多靶点药物设计策略。将受体拮抗剂与自由基清除剂通过合理的化学结构设计合成为单一分子，可能为治疗多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症等目前缺乏有效再生疗法的脱髓鞘疾病开辟新的途径。未来的研究方向包括在更复杂的体内疾病模型（如EAE或cuprizone模型）中验证P686的疗效，并进一步阐明其双重作用背后的分子机制，例如是否涉及NRF2等抗氧化通路的上调。该研究为开发下一代神经保护和治疗性髓鞘再生药物奠定了坚实的基础。