综述：极端嗜热嗜酸泉古菌的全细胞生物技术应用：机遇与挑战

《Process Biochemistry》：Whole-cell biotechnological applications with thermoacidophilic Crenarchaeota: opportunities and challenges

本综述系统探讨了极端嗜热嗜酸泉古菌（Crenarchaeota），特别是硫化叶菌目（Sulfolobales）成员在生物采矿（Biomining）、生物催化和生物精炼（Biorefinery）领域的巨大应用潜力。文章重点介绍了硫化叶菌（Sulfolobus）、酸菌（Acidianus）和金属球菌（Metallosphaera）等属的独特生理特性（如高温（≥75°C）、低pH（≤4.0）适应性）、遗传工具开发进展及其在金属浸出（Bioleaching）和木质纤维素转化（Lignocellulosic Biomass Conversion）中的前沿应用，为开发下一代工业生物技术平台提供了创新视角。

　　

1. 引言

极端嗜热嗜酸古菌是一类能在高温、强酸等极端环境中旺盛生长的微生物，其独特的代谢途径和酶系统（如极端酶/热酶，Extremozymes/Thermozymes）因其增强的刚性和稳定性，在有机溶剂和离子液体中仍能保持活性，为工业生物催化提供了巨大潜力。硫化叶菌目（Sulfolobales）作为该类古菌中研究最深入的谱系，其成员（如Acidianus, Metallosphaera, Sulfolobus）不仅能氧化亚铁和还原性无机硫化合物（RISCs），应用于生物采矿，还因其遗传系统的可操作性，被视作合成生物学和代谢工程的理想“底盘”平台。

2. 嗜热嗜酸泉古菌的天然生活方式

硫化叶菌目主要由三个分支构成：Acidilobales、Sulfolobales和Thermoproteales。其中，Sulfolobales是研究最为深入的古菌谱系，包含超过30个已命名物种，跨7个属。这些微生物发现于全球各地的陆地热泉，生理特性多样，包括极端到中度的嗜酸性和嗜热性，兼有专性或兼性需氧、专性厌氧、金属氧化、硫还原/氧化、化学异养和化学自养等多种生活方式。其自养生活方式依赖于高度保守的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸（3-HP/4-HB）循环来固定CO₂，该途径利用 bicarbonate 而非 CO₂，避免了对RuBisCo的依赖。

3. 嗜热嗜酸古菌的生物技术潜力

3.1. 酶生产

硫化叶菌属（如S. acidocaldarius, S. islandicus, S. solfataricus）是构建复杂生物合成设计的潜在宿主。其极端特性（高温低pH）带来了污染风险低、底物溶解度更高、酶热稳定性强以及能耗成本低等工业应用优势。这些古菌的胞外酶（如淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶）适应低pH，与涉及高温低pH的木质纤维素预处理工艺设计高度契合。其酶（如S. solfataricus的二羟酸脱水酶（DHAD））已被用于构建人工酶 cascade，以无细胞方式从葡萄糖生产乙醇和异丁醇。此外，其磷酸三酯酶样内酯酶可用于有机磷农药和战剂的去污，而脂质则因其稳定性被提议作为药物递送载体。

3.2. 嗜热嗜酸古菌的生物采矿应用

生物浸出是一个成熟的工业操作，利用嗜酸微生物从矿物矿石中 mobilization 金属。极端嗜热嗜酸古菌，如Acidianus, Metallosphaera 和 Sulfolobus，因其氧化亚铁和/或RISCs的先天能力而获得认可。金属从硫化物和氧化物中的微生物 mobilization 主要是间接发生的，Fe³⁺非生物地氧化固体材料，产生Fe²⁺，随后微生物将其重新氧化为Fe³⁺。硫化矿物的生物浸出存在两种主要机制：硫代硫酸盐机制和聚硫化物机制。

3.2.1. 硫化叶菌（Sulfolobus）

S. metallicus 和 S. acidocaldarius 等成员可用于 mobilization 铜、锌和铀，并有助于煤炭脱硫。它们还能将亚砷酸盐（As³⁺）氧化为砷酸盐（As⁵⁺），与砷解毒和生物修复相关。S. acidocaldarius 能够在多金属废物产品（如BOF粉尘）存在下进行化能自养生长，并将Mn、Zn和Fe溶解到浸出液中。

3.2.2. 金属球菌（Metallosphaera）

Metallosphaera 菌株通过附着在底物上并再生Fe²⁺为Fe³⁺来 solubilize 金属，这对矿物的化学攻击至关重要。M. sedula 是研究极端嗜热嗜酸古菌金属生物氧化的模型系统。研究表明，用不同能源底物繁殖的 M. sedula 接种物在随后的黄铜矿生物浸出中表现出不同的能力，其中用黄铜矿繁殖的接种物在整个浸出过程中铜回收率最高。

3.2.3. 酸菌（Acidianus）

极端嗜热菌如 Acidianus brierleyi 本质上适合高温操作。A. brierleyi 通过 S⁰ 或 Fe²⁺ 氧化还原化学进行化能自养繁殖，并提供比中温细菌 Acidithiobacillus ferrooxidans 更高的闪锌矿浸出率。A. manzaensis YN25 对多金属共存系统中的金属离子表现出不同的生物吸附行为，其对Cu²⁺的吸附能力最强。

4. 遗传工具开发

为微生物开发遗传系统的第一步是建立将外源DNA导入细胞的有效方法，即转化。电穿孔被证明是一种将SSV1 DNA等外源遗传元件导入宿主基因组的高效方法。基于隐秘质粒pRN1和pRN2的硫化叶菌-大肠杆菌穿梭载体已被构建出来。除了传统的营养缺陷型标记（如pyrEF），新的选择系统如agmatine/argD系统和反选择系统如apt/6-MP（腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因/嘌呤类似物6-甲基嘌呤）系统已被开发，使得在硫化叶菌中构建无标记基因敲除菌株成为可能。此外，基于hmg基因（编码3-羟基-3-甲基-辅酶A（HMG-CoA）还原酶）的突变非依赖性选择标记也已成功应用。lacS基因（编码β-糖苷酶）被选作报告基因，用于分析体内启动子活性。合成生物学方法，如CRISPR-Cas系统，也已应用于基因删除和基因沉默，将硫化叶菌遗传学推入了后CRISPR时代。

5. 嗜热嗜酸古菌的生物精炼应用

5.1. 原料转化能力

硫化叶菌属拥有多种众所周知的糖转运和降解途径，且缺乏分解代谢物阻遏，因此可以同时利用己糖和戊糖。D-葡萄糖和D-半乳糖通过修饰的、混杂的分支Entner-Doudoroff（ED）途径降解，而戊糖（D-阿拉伯糖和D-木糖）则通过氧化的Weimberg和Dahms途径降解。代谢工程和合成生物学方法的近期发展，使得建立硫化叶菌作为平台生物成为可能，用于将可持续的廉价原料（如木质纤维素生物质）转化为高附加值产品。将生物质预处理与利用嗜热嗜酸古菌（如S. solfataricus和S. acidocaldarius）的工艺以整合生物加工（CBP）形式相结合，将进一步提高从木质纤维素原料生产高价值生化品的效率。

5.2. 生物过程开发

S. acidocaldarius 被认为是一种有前途的平台生物，适用于生物技术应用。它是可遗传操作的，从而能够进行代谢工程以适应工业过程的潜在应用。其生物膜生活方式增强了对不利环境条件（如有毒反应物或产物）的耐受性。研究表明，S. acidocaldarius 能够耐受有机溶剂（如丁醇、乙醇），并且有机溶剂胁迫增强了生物膜形成和胞外聚合物（EPS）组成。其培养的简便性，加上相对较低的氧气需求和在生物反应器中实现高细胞密度培养的潜力，使其对大规模工业过程极具吸引力。维也纳限定培养基（VD Medium）的开发为了在受控环境中进行可重复的培养和生理菌株表征提供了解决方案。

5.3. 目标产品

通过合成生物学和代谢工程，极端嗜热嗜酸古菌有潜力作为平台生物，利用廉价原料（如木质纤维素生物质）生产高价值和高附加值产品，例如乙醇、丁醇、1,2,4-丁三醇（BT）、1,4-丁二醇（BDO）、乙二醇（EG）、乙醇酸、聚羟基烷酸酯（PHA）、四醚脂质（TELs）和3-羟基丙酸（3-HP）。这些产品是化石基燃料和产品的潜在替代品，具有广泛的应用前景，从可再生能源和化学品到生物可降解塑料和医药载体。

6. 结论

合成生物学、代谢工程方法以及允许在搅拌罐生物反应器中进行连续培养的生物过程的近期发展，为利用硫化叶菌作为微生物细胞工厂开辟了道路。通过这些发展，可以将廉价的原料（如木质纤维素生物质）转化为工业相关的化合物。尽管在实验室和中试规模上利用嗜热嗜酸古菌作为微生物细胞工厂取得了进展，但其商业规模的应用仍然面临挑战。因此，未来的研究应侧重于利用嗜热嗜酸古菌的全细胞和更廉价的底物（如木质纤维素生物质）进行整合生物加工，以提高工艺效率并降低生产成本。