单细胞图谱揭示食管鳞癌免疫生态系统中CD39+ T细胞与PD-L1+巨噬细胞对免疫治疗反应的预测价值

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Single-cell atlas of the esophageal squamous cell carcinoma immune ecosystem to predict immunotherapy response

本研究通过质谱流式技术构建食管鳞癌免疫生态系统单细胞图谱，发现肿瘤微环境中CD4+/CD8+中央记忆T细胞缺失而CD39+ T细胞与PD-L1+肿瘤相关巨噬细胞富集。体外实验证实补充TCM可恢复抗肿瘤活性，PD-L1阻断能重编程巨噬细胞向促炎表型，CD39+ T细胞与良好预后及PD-1阻断疗效相关，为ESCC免疫治疗提供新型生物标志物和联合治疗策略。

　　

食管癌是全球范围内具有显著疾病负担的恶性肿瘤，尤其在东亚地区呈现高发病率与高死亡率特征。其中食管鳞状细胞癌（ESCC）作为主要病理亚型，占中国食管癌病例的90%以上。由于早期诊断困难且易发生局部侵袭和转移，晚期ESCC患者五年生存率仅为15%-25%。当前治疗手段有限，亟需深入解析肿瘤微环境（TME）的免疫调控机制以开发有效免疫治疗策略。

ESCC具有高度的基因组和表观遗传异质性，导致治疗抵抗。近年来单细胞RNA测序、飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）和多色免疫组化（mIHC）等高通量技术的应用，逐步揭示ESCC肿瘤微环境中耗竭性CD8⁺ T细胞、调节性T细胞（T_reg）和替代激活型巨噬细胞共同促进免疫逃逸的复杂景观。然而，对关键免疫细胞亚群的空间分布、功能状态及其与治疗响应关联的系统性认知仍存在空白。

为解决这一难题，研究团队对25例ESCC患者的肿瘤组织、癌旁正常组织和外周血样本进行大规模质谱流式分析，采用包含42种免疫标志物的抗体panel，绘制了超过1000万个细胞的单细胞分辨率免疫图谱。通过整合单细胞转录组测序和空间多色免疫组化技术，重点探究了三个核心科学问题：不同组织区域中特定细胞状态与空间分布的规律性特征；CD39^high T细胞群体和PD-L1⁺ TAMs是否捕获与治疗响应相关的生物学特征；记忆T细胞池的功能缺陷是否可通过靶向补充策略修复。

关键技术方法包括：从25例初治ESCC患者获取匹配的外周血、癌旁组织和肿瘤组织样本，通过质谱流式技术（CyTOF）进行高维蛋白质组分析；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）验证关键发现；采用多色免疫组化（mIHC）解析免疫细胞空间分布；建立患者来源类器官（PDO）与自体中央记忆T细胞（T_CM）共培养体系评估细胞毒性；使用4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）诱导的小鼠ESCC模型进行体内功能验证。

单细胞蛋白质组图谱揭示ESCC主要免疫细胞类型

研究通过t-SNE可视化分析发现肿瘤与癌旁组织免疫组成高度相似，而外周血呈现独特谱系特征。差异主要体现在树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴系细胞（CD4⁺ T、B、γδ T和NK细胞）的分布变化。淋巴结转移患者外周血中γδ T细胞显著富集，提示其作为转移负荷潜在生物标志物的价值。高级别（G3/G4）肿瘤中巨噬细胞浸润程度显著高于G2肿瘤，表明恶性程度与髓系细胞浸润正相关。

ESCC TME中T_reg富集的CD4⁺ T细胞表型

研究人员鉴定出12个CD4⁺ T细胞亚群，其中调节性T细胞（T_reg，C20/C21/C24簇）在肿瘤组织中浸润率高达48.5%，显著高于外周血（6.0%）和癌旁组织（17.1%）。这些T_reg呈现CD25⁺FOXP3⁺ICOS⁺典型活化抑制表型，特别是CD39⁺亚群（C20）在肿瘤中特异性富集。与之相反，中央记忆T细胞（T_CM，C12）在肿瘤组织中比例（6.7%）显著低于癌旁组织（16.7%），提示TME中存在记忆T细胞缺陷。

CD8⁺ T细胞表型特征与T_CM抗肿瘤策略

CD8⁺ T细胞被分为11个功能亚群，包括初始型（C09）、中央记忆型（T_CM，C08/C10）、耗竭型（T_EX，C27/C28/C30/C34）等。值得注意的是，CD39⁺PD-1⁺ T_EX细胞（C27/C28）在肿瘤组织中显著富集（合计31%），同时表达ICOS等共刺激分子，显示其处于"可复活"的过渡状态。通过患者来源类器官（PDO）与自体CD62L⁺ T_CM共培养实验，证实补充T_CM可显著诱导肿瘤细胞死亡（Annexin V⁺/PI⁺），恢复抗肿瘤细胞毒性功能。

PD-L1^high巨噬细胞与免疫治疗获益相关

髓系细胞分析识别出7个亚群，包括经典单核细胞（cMo）、中间单核细胞（iMo）、非经典单核细胞（ncMo）等。CD206⁺HLA-DR⁺CD204^-巨噬细胞在肿瘤组织中占比达66.2%，且与PD-L1表达显著共定位。ECGEA队列RNA-seq数据分析显示肿瘤组织中巨噬细胞特征基因表达上调，CD274（PD-L1）表达升高，且与CD8⁺ T细胞浸润正相关（rho=0.4735, P<0.0001）。在黑色素瘤和泛癌免疫治疗队列中，PD-L1^high患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）均显著改善。体外功能实验表明，PD-L1阻断可重编程巨噬细胞向促炎表型转化，上调IL-12、IL-1β、iNOS表达，下调IL-4、ARG1等免疫抑制基因。

肿瘤内CD39⁺ T细胞与良好预后相关

CyTOF和10X Genomics分析均显示肿瘤内CD8⁺和CD4⁺ T细胞中ENTPD1（CD39）表达显著上调。mIHC验证CD39在肿瘤浸润T细胞上的高表达，且与ITGAE（CD103）表达正相关（rho=0.2671, P=0.0008）。生存分析显示，在CD8^high肿瘤中，ENTPD1^high患者预后更佳（HR=0.41, P=0.015）。这一趋势在TCGA-ESCA、TCGA-CESC和TCGA-HNSC等多个鳞癌队列中得到验证。功能实验表明，CD39抑制剂ARL67156处理可削弱CD8⁺ T细胞的细胞毒性，降低IFN-γ和颗粒酶B（GZMB）表达，证实CD39⁺ T细胞在抗肿瘤免疫中的关键作用。

CD39高表达患者从免疫治疗中获益

单因素Cox回归显示ENTPD1高表达与ESCC患者抗PD-1治疗响应显著相关（P=0.041），多因素分析中仍保持独立性（P=0.011）。CD39预测免疫治疗响应的AUC达0.702，特异性0.938，优于CD103和PD-1。在4NQO诱导的ESCC小鼠模型中，抗PD-1治疗显著增加肿瘤内CD39⁺CD8⁺和CD39⁺CD4⁺ T细胞频率。对公共scRNA-seq队列的再分析证实，治疗前CD39⁺ T细胞在应答者中富集，治疗后仍维持较高水平。黑色素瘤和非小细胞肺癌（NSCLC）队列数据进一步验证CD39⁺ T细胞作为免疫治疗响应预测标志物的普适性。

本研究通过整合多组学技术系统描绘了ESCC免疫生态系统的单细胞图谱，揭示了CD39⁺ T细胞和PD-L1⁺巨噬细胞作为预后标志物和治疗靶点的双重价值。研究发现ESCC肿瘤微环境中存在T_CM细胞缺陷、T_reg细胞富集以及T细胞耗竭状态异质性等特征。特别值得注意的是，CD39在肿瘤反应性T细胞中表达升高，既标志着免疫功能失调，又提示其作为可调控靶点的潜力。PD-L1⁺巨噬细胞的可塑性特征为联合免疫治疗提供新思路。这些发现为开发基于免疫特征谱的个体化治疗策略奠定基础，有望改善ESCC患者的临床预后。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志，为理解肿瘤免疫微环境调控机制和优化免疫治疗策略提供了重要理论依据和实践指导。