甲醛蒸气固定技术实现人肺多尺度相衬成像与组织学验证的新突破

《Scientific Reports》：Formaldehyde vapour fixation enables multiscale phase-contrast imaging and histological validation of human-sized lungs

本研究针对离体人肺成像中组织结构塌陷和固定技术不兼容的难题，开发了一种甲醛蒸气固定新方法。研究人员通过优化Weibel-Vidone经典方法，在人体胸部模体中对肺标本进行蒸气固定，成功保持了肺的生理膨胀状态和空气-组织界面完整性。该技术使同一标本能够实现从器官水平(67μm)到细胞水平(650nm)的多尺度相衬成像，并与组织学结果建立精确对应，为肺部疾病的高分辨率影像诊断提供了重要技术支撑。

　　

肺部疾病的精准诊断迫切需要能够分辨细微结构的先进成像技术，同时还要尽可能降低辐射暴露。传统的X射线成像依赖于组织对X射线的吸收差异，但由于软组织吸收较弱，在标准放射摄影中对比度较差。此外，X射线吸收会导致能量在组织中沉积，产生众所周知的副作用，限制了传统X射线成像在患者中的充分应用。

为了克服这些限制，暗场成像和相衬成像等新型X射线技术应运而生。其中，自由传播相衬成像具有最简单的实验设置，仅需在物体和探测器之间保持足够的传播距离，无需额外的光学元件。然而，该技术要求入射X射线束具有高度的空间相干性，限制了其只能在配备纳米焦点源的微CT系统或同步辐射装置中应用。

在肺部成像领域，一个长期存在的挑战是离体肺标本的固定问题。肺组织含有约0.5升的组织嵌入在几升空气中，切除后会迅速塌陷，严重影响成像质量与组织学验证之间的空间配准。传统的液体福尔马林固定方法会取代空气-组织界面，严重降低相衬成像的图像质量。

), with a valve(H) allowing for pressure adjustment. A water-filled scavenger(G) prevents FA vapour from reaching the pump. The vapour is generated by boiling formalin(A)and cooled in a water bath(W) prior to entering the lung.(d) Photograph of the lung following 4 hours of FA vapour fixation. The majority of the lung surface() exhibits a characteristic brownish colouration, indicating full penetration of the fixative. Some peripheral regions($), in direct contact with the phantom wall, remain partially unfixed at this stage but were fully fixed by the end of the 6 h protocol.'>

针对这一技术瓶颈，由Christian Dullin和Johanna Reiser共同领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究，他们成功开发了一种适配的甲醛蒸气固定方案，能够将人肺大小的肺标本维持在生理膨胀和形态稳定状态。这种方法防止了脆弱的气-组织界面塌陷，为高保真相衬成像和组织学关联研究扫除了主要障碍。

关键技术方法概述

研究团队从屠宰场获取成年家猪肺(体重约80kg)和从慕尼黑工业大学动物研究中心获取微型猪肺(体重约40kg)作为实验样本。核心技术包括：(1)使用人体胸部模体维持肺的被动膨胀状态；(2)甲醛蒸气固定系统，通过加热10%福尔马林产生蒸气，在负压下导入肺气道；(3)多尺度相衬成像，包括近场传播相衬成像(67μm)、高分辨率近场相衬成像(4.5μm)和超高分辨率远场相衬成像(650nm)；(4)组织学处理与定量评分系统评估固定效果。

研究结果

Workflow and FA vapour fixation setup

研究团队设计了一套完整的甲醛蒸气固定系统，核心部件是人体胸部模体，该模体包含容纳肺标本的内壳、模拟胸壁和骨骼的外壳、产生负压的真空泵和模拟呼吸的运动系统。固定过程中，新鲜猪肺直立安装在内壳中，气管连接到甲醛蒸气发生器，通过负压将蒸气被动吸入肺气道。

FA vapour fixation preserves NF-PBI image quality

研究表明，甲醛蒸气固定的肺保持了与新鲜标本相当的形态特征，没有明显的图像质量损失。新鲜微型猪肺在负压被动膨胀下的三维渲染图像与经过6小时甲醛蒸气固定后扫描的图像相比，虽然观察到轻微变形，但整体图像质量相当，细小气道结构的分辨率得到保持。固定约四周后，肺组织切片进行组织学处理，苏木精-伊红染色显示肺泡结构保存完好，验证了甲醛蒸气固定对成像和组织病理学工作流程的适用性。

FA vapour fixation enables multiscale phase-contrast imaging

甲醛蒸气固定保持了肺的生理膨胀状态，实现了分层成像和跨尺度数据关联。研究人员展示了从整个器官(67μm)到组织(4.5μm)再到细胞分辨率(0.65μm)的三个空间数量级的高分辨率成像兼容性。这种多尺度成像流程证实了甲醛蒸气固定在跨越不同空间尺度的高分辨率成像中的兼容性。

FA vapour-fixed lungs show well-preserved alveolar architecture in histology

除了相衬成像兼容性外，组织形态的有效保存也至关重要。甲醛蒸气固定的微型猪肺的苏木精-伊红染色切片显示肺泡结构保存良好。高倍镜分析显示规则的腺泡结构，具有开放的肺泡气腔。肺泡间隔显得细薄且呈直线走向，表明肺在固定时处于充气状态，表面张力有助于肺泡微结构的保存。

相比之下，传统液体福尔马林固定的肺标本显示肺泡气腔部分塌陷，肺泡间隔更厚，呈现更波浪状的构型。定量组织学评分由四名盲法评审员对四个参数(肺泡大小、肺泡大小均匀性、肺泡壁薄度和无破裂)进行评估，结果显示甲醛蒸气固定与传统福尔马林灌注在组织学表现上无统计学显著差异。

Current set-up limitations and future optimization strategies

研究也识别了当前设置的局限性。有效的甲醛蒸气固定需要足够的负压和动态调节吸入速率以维持适当的被动肺膨胀。组织在固定过程中刚度增加时，动态调整和仔细监测吸入变得至关重要，以防止固定伪影。

图中展示了固定过程中遇到的各种挑战，包括过度负压导致的组织破裂和过度扩张、气管密封不良导致的外周固定不全、蒸气冷凝导致的液体积累影响软组织对比度，以及负压不足导致的致密不规则肺形态。针对这些挑战，研究团队正在开发改进设置，采用雾化器输送冷甲醛蒸气，并在模体系统内集成压力传感模块，实现固定过程中压力的精确实时测量。

研究结论与意义

这项研究成功适配了Weibel和Vidone最初描述的甲醛蒸气固定技术，用于人体胸部模体中人肺大小的肺标本。该方法可靠地将肺保持在扩张状态，能够在固定前后进行直接、高保真的近场传播相衬成像比较，且没有观察到明显的图像质量下降。固定后的标本保持刚性且形态稳定，便于标本处理和后续组织采集。

该固定策略的关键优势在于能够通过保持离体肺结构完整性，实现多尺度相衬成像和影像学发现的组织学验证。对于人肺来说，含有约0.5升组织嵌入在几升空气中，切除后会迅速塌陷，严重损害离体组织学评估，并阻碍与切除前成像模式的准确配准。

随着第一代光子计数探测器临床CT系统进入市场，其在相等或更低剂量水平下实现了比传统临床CT更高的空间分辨率。本研究中的全肺近场传播相衬成像在67μm体素大小下进行，超过了最新超高分辨率CT系统通常约200μm的平面内分辨率。考虑到人肺泡大小在200-300μm范围内，在某些情况下可能需要近场传播相衬成像提供的更高分辨率。

重要的是，甲醛蒸气固定为跨空间尺度和模态的肺部疾病研究提供了新机会。其与同步辐射和微CT成像的兼容性允许对疾病模型(如纤维化、肺炎或肺气肿)进行详细的结构映射，同时保持组织病理学解释的空间背景。这在移植等场景中特别有价值，人离体肺可以在切除后立即在生物安全条件下固定，支持影像特征与组织学诊断的回顾性或前瞻性关联。

总之，这种适配的甲醛蒸气固定方法为多模态和多尺度成像过程中保持肺结构提供了实用且可扩展的解决方案。与高分辨率相衬成像结合时，它为跨健康和疾病状态的肺微结构进行全面定量分析开辟了可能性。随着成像技术的不断进步，如此处提出的标准化离体制备方案，对于整合跨尺度和模态的肺部研究数据以及促进临床转化至关重要。