外膜自转运蛋白Fap2和CmpA介具核梭杆菌与放线菌聚集杆菌b/d血清型特异性共聚集的机制研究

《Applied and Environmental Microbiology》：The outer membrane autotransporters Fap2 and CmpA facilitate specific coaggregation between Fusobacterium nucleatum and Aggregatibacter actinomycetemcomitans serotypes b and d

本研究揭示了牙周关键病原菌具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）通过其外膜自转运蛋白Fap2和CmpA，分别与放线菌聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）血清型b和d发生特异性共聚集的分子机制。该共聚集由自转运蛋白与细菌表面脂多糖（LPS）的O-多糖特异性相互作用介导，并显著促进双物种生物被膜形成。此发现不仅阐明了牙菌斑形成的分子基础，也为理解具核梭杆菌在牙周病及全身性疾病（如心血管疾病、癌症）中的作用提供了新视角。

　　

引言

牙菌斑是一种在多物种细菌生物被膜，形成于牙齿表面，是导致牙周炎的主要因素之一。具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）是人口腔中的主要共生菌，也是牙周病原体，在龈下牙菌斑中 predominantly 存在。该菌作为一种“桥接”菌，能够与多种口腔细菌发生共聚集，连接早期定植菌（如链球菌、放线菌）和晚期定植菌（如牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体），从而在牙菌斑发育中发挥关键作用。此外，具核梭杆菌还与全身性疾病相关，如心血管疾病、不良妊娠结局和癌症。其表面表达的自转运蛋白（如Fap2）可与宿主细胞碳水化合物结合，促进其在癌组织中的定植。

放线菌聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）是另一种与牙周炎，特别是侵袭性牙周炎相关的革兰氏阴性兼性厌氧菌。根据其脂多糖（LPS）O-多糖（O-PS）区域的抗原性，可分为a至g共七种血清型。其中，血清型b、a、c在牙周炎病例中较为常见，血清型b的JP2克隆株因高产量白细胞毒素而与侵袭性牙周炎密切相关。

先前的研究表明放线菌聚集杆菌可与具核梭杆菌发生共聚集，但其分子机制及血清型特异性尚未明确。本研究旨在阐明具核梭杆菌与不同血清型放线菌聚集杆菌之间的共聚集特性及其分子基础。

结果

具核梭杆菌与放线菌聚集杆菌血清型b和d发生特异性共聚集

研究检测了两株具核梭杆菌（ATCC23726和ATCC25586）与代表a、b、c、d、g血清型的九株放线菌聚集杆菌的共聚集能力。结果显示，两株具核梭杆菌均与所有测试的血清型b菌株（HK1651, ATCC29522, ATCC29524, Y4）以及血清型d菌株（IDH781）发生强烈共聚集，聚集百分比高达约80%，显著高于各自的自聚集水平。尽管血清型a和g菌株在试管中也出现聚集，但这主要是其自身的自聚集所致。因此，具核梭杆菌特异性与放线菌聚集杆菌血清型b和d发生共聚集。

具核梭杆菌通过结合O-抗原多糖与血清型b和d共聚集

为探究共聚集的分子机制，研究分析了放线菌聚集杆菌LPS的作用。结果显示，从血清型b菌株HK1651中提取的LPS能显著抑制其与具核梭杆菌的共聚集，血清型d和g的LPS也有不同程度的抑制作用。进一步分析O-PS中的单糖成分发现，对于血清型b（其O-PS含D-岩藻糖、L-鼠李糖和N-乙酰-D-半乳糖胺），N-乙酰-D-半乳糖胺的抑制作用最强。类似地，对于血清型d（其O-PS含D-葡萄糖、D-甘露糖和L-鼠李糖），L-鼠李糖能显著抑制其与具核梭杆菌的共聚集。这些糖类不影响细菌的自聚集。

具核梭杆菌通过自转运蛋白与血清型b和d共聚集

鉴于自转运蛋白是具核梭杆菌介导种间共聚集的关键因子，研究构建了八个不同自转运蛋白基因的突变株。共聚集实验表明，与野生型相比，fap2基因突变株与血清型b菌株（HK1651等）的共聚集能力显著降低约90%。同样，cmpA基因突变株与血清型d菌株（IDH781）的共聚集能力显著降低约91%。其他自转运蛋白基因的突变则未显著影响共聚集。此外，在共聚集反应中加入L-精氨酸对具核梭杆菌与血清型d的共聚集仅有轻微抑制，表明该相互作用主要不依赖精氨酸。

具核梭杆菌与放线菌聚集杆菌血清型b或d的共聚集促进生物被膜形成

通过共培养生物被膜形成实验，研究发现具核梭杆菌野生型与血清型b菌株HK1651共培养时，能形成显著的生物被膜，而两者单独培养时均无法形成可检测的生物被膜。当与fap2突变株共培养时，生物被膜量显著减少47%。对于能独自形成生物被膜的血清型d菌株IDH781，与具核梭杆菌野生型共培养可使其生物被膜量增加33%，而与cmpA突变株共培养则使生物被膜量减少49%。这表明特异性共聚集能协同促进双物种生物被膜的发育。

讨论

本研究证实了具核梭杆菌与放线菌聚集杆菌血清型b和d的特异性共聚集机制。血清型b的共聚集由具核梭杆菌自转运蛋白Fap2识别其LPS O-PS上的N-乙酰-D-半乳糖胺残基介导。这与之前报道的Fap2作为半乳糖敏感性黏附素，可结合肿瘤细胞表面的Gal-GalNAc以及介导与粪肠球菌的共聚集相一致。

血清型d的共聚集则由具核梭杆菌自转运蛋白CmpA识别其LPS O-PS上的L-鼠李糖残基介导。虽然CmpA此前已知以精氨酸抑制的方式介导与链球菌等的共聚集，但本研究中的共聚集主要为精氨酸非依赖性。值得注意的是，链球菌戈登亚种的共聚集受体多糖中也含有鼠李糖残基。

对不同血清型LPS抑制效果的分析表明，O-PS侧链上的糖残基在共聚集识别中可能比主链糖更具优势。例如，缺乏侧链糖的血清型g虽含有主链鼠李糖，但并未与具核梭杆菌发生可检测的共聚集。

在生物被膜形成方面，共聚集通过促进细菌细胞在底物表面的沉降和积累，或利用一方预先形成的生物被膜作为支架，显著增强了混合物种生物被膜的形成能力。这从临床角度揭示了这两种牙周病原菌通过物理互作加速牙菌斑成熟的潜在途径。

结论

本研究阐明了牙周病原菌具核梭杆菌与放线菌聚集杆菌血清型b和d之间特异性共聚集的分子机制，该机制依赖于具核梭杆菌外膜自转运蛋白（Fap2和CmpA）与放线菌聚集杆菌LPS O-多糖的特异性相互作用，并显著促进生物被膜形成。随着具核梭杆菌和放线菌聚集杆菌在牙周病以外的全身性疾病中被日益关注，本研究为理解这些病原菌通过特异性分子相互作用定植宿主组织的机制提供了新的重要见解。

材料与方法

细菌菌株与培养条件

具核梭杆菌菌株在TSPC培养基中厌氧培养。放线菌聚集杆菌菌株在AAGM培养基中于5% CO₂环境下培养。

具核梭杆菌突变株的构建

通过同源重组方法，利用质粒pJIR750插入失活靶向的自转运蛋白基因，并通过PCR验证插入成功。

放线菌聚集杆菌LPS的制备

采用改良的酚水法从不同血清型放线菌聚集杆菌菌株中提取和纯化LPS。

聚集实验

将细菌重悬于共聚集缓冲液（CAB）中，混合后观察聚集现象，并通过测量光密度变化定量聚集百分比。使用含特定糖类或LPS的缓冲液进行抑制实验。

共培养生物被膜实验

将细菌共培养于96孔板中，厌氧培养24小时后，通过结晶紫染色法定量生物被膜质量。

统计分析

使用EZR进行统计学分析，采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey's或Dunnett's多重比较检验，P < 0.05认为有统计学意义。