大型藻类附生浮霉菌门细菌的耐氧固氮作用及其生态意义

《Applied and Environmental Microbiology》：Oxygen-tolerant nitrogen fixation in a marine alga-colonizing Planctomycetota

本研究首次实验验证了海洋浮霉菌门（Planctomycetota）细菌Crateriforma sp. HD03在纯培养条件下的耐氧固氮能力，其固氮速率达14.2 ± 1.5 nmol C2H4/(107 cells)/h。基因组分析揭示了其通过生物膜形成、hopanoid脂质合成、FeSII蛋白等六种适应机制抵抗氧胁迫，并与大型藻类形成昼夜节律性互作（nifH基因表达在暗期达峰）。该研究通过功能验证与基因组调查，确立了浮霉菌门在海洋氮输入中的关键地位。

　　

INTRODUCTION

大型藻类（如海带）表面构成了海洋生物地球化学循环的关键微生态系统，其附生的微生物群落调控着藻类适应性和营养通量。在这些群落中，浮霉菌门（Planctomycetota）通常是优势类群。尽管已在浮霉菌门分离株和宏基因组组装基因组（MAGs）中鉴定到固氮酶（nif）基因簇，但在纯培养中对固氮作用的功能验证一直缺失。此外，这些细菌如何在藻类相关的有氧生态位中克服氧敏感性并实现固氮的机制亦未探索。

ISOLATION AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A NITROGEN-FIXING PLANCTOMYCETOTA STRAIN FROM KELP SURFACE

为填补浮霉菌门固氮功能验证的空白，研究人员使用添加了抗生素的M14培养基从褐藻（Saccharina japonica）表面微生物群中培养，并通过连续划线分离得到纯培养菌株HD03。其16S rRNA基因序列与Crateriforma conspicua Mal65^T 100%相同，但数字化DNA-DNA杂交显示相似性为50.9%，确认为遗传上独特的菌株。

HD03在M14琼脂上形成浅粉色光滑菌落，卵圆形细胞（0.5至1.0 μm）呈玫瑰花结状聚集并具有丝状附属物——浮霉菌门的典型特征。其在液体培养基中70小时到达稳定期，倍增时间为10.8小时。HD03表现出卓越的适应性：可在10至40°C的温度范围（最适33°C）和pH 5至9（最适7.5）下生长，并能利用多种碳源。此外，HD03对31种测试药物中的21种具有抗性，这与浮霉菌门各支系普遍存在的抗生素抗性特征一致。

为验证固氮功能，HD03在无氮（NF）培养基中生长，5天后OD₆₀₀达到0.8，证明其利用大气氮进行生长。值得注意的是，HD03无法在厌氧条件下生长，证实了其专性需氧固氮的特性。乙炔还原测定（ARA）显示，在溶解氧（DO）为8 mg/L条件下，其需氧固氮速率为14.2 ± 1.5 nmol C₂H₄/(10⁷ cells)/h。在控制DO（4–16 mg/L）的条件下，HD03均能维持nifH基因表达和固氮酶活性，ARA测量值在13.1 ± 0.6至14.2 ± 1.5 nmol C₂H₄/(10⁷ cells)/h之间，证明了其在需氧固氮过程中缓解氧胁迫的能力。这些结果共同证实HD03是首个在纯培养中经实验验证的海洋浮霉菌门固氮菌。

透射电子显微镜（TEM）显示，HD03在氮限制条件下（NF培养基）细胞内有微区室样结构。

MOLECULAR AND PHYSIOLOGICAL STRATEGIES ENABLING AEROBIC NITROGEN FIXATION IN CRATERIFORMA SP. HD03

HD03的一个显著生理特性是能在高氧张力下维持显著的固氮活性。在DO为16 mg/L时，其nifH表达和固氮速率（13.1 ± 0.6 nmol C₂H₄/(10⁷ cells)/h）与4 mg/L DO时相比仍可检测，且仅略低于8 mg/L DO时的峰值速率。这种耐受性远超报道的Pseudomonas stutzeri BAL361的阈值（5.28 mg/L），并与大多数需要微氧或厌氧生态位来保护氧敏感固氮酶的固氮菌形成对比。

为解析这种适应的分子基础，研究人员通过混合基因组测序获得了HD03的7.22 Mb基因组。基因组筛选发现了一个完整的nifHDKBEN基因簇，编码经典的钼依赖固氮酶复合体。未检测到替代固氮酶基因（vnf/anf），表明其严格依赖钼基系统，这在其他需氧固氮菌中也有观察。

随后，研究人员确定了支撑HD03固氮过程中耐氧性的六个相互关联的基因组模块：

i. 酶促氧清除与结构保护：nif基因簇包含氢化酶（hya）和Shethna蛋白II（FeSII）基因，形成双重防御系统。氢化酶介导的H₂氧化消耗细胞内氧气同时产生ATP，建立有利于固氮酶活性的微氧生态位。同时，FeSII蛋白通过构象变化稳定固氮酶金属簇，保护其免受氧化损伤。

ii. 转录与氧代谢调控：nifA基因编码一种响应氧状态的转录调节因子。fixOPGHIS操纵子进一步调节呼吸耗氧，动态维持适于固氮酶活性的微氧环境。

iii. 氧化还原网络多样化：与三个氢化酶基因相关的rnfABCDEG基因簇编码电子传递复合体，这种冗余性使得能够从多种供体（如H₂、藻类渗出物）灵活获取电子，支持跨氧梯度的固氮酶活性。

iv. 膜脂介导的氧屏障：甾醇/藿烷类合成基因（crtB和she）修饰膜特性。藿烷类嵌入磷脂双层以降低流动性和氧渗透性，而甾醇增强膜结构稳定性。这种脂质重塑创建了物理屏障，将固氮酶隔离在微区内，最大限度地减少直接氧暴露。

v. 生物膜驱动的微环境：多糖生物合成基因（kps, exo）促进聚集体或生物膜形成。这些结构中的外层细胞通过呼吸消耗氧气，形成理想的固氮微氧核心。生物膜附着于藻类表面进一步减少了氧暴露，同时优化了营养摄取，这与颗粒关联海洋固氮菌的策略相似。

vi. 微区室化潜力：与细菌微区室相关的基因（ackA）表明了一种将固氮酶封装在蛋白质结构中的机制。显微镜在氮限制条件下观察到了微区室样结构，但其在氧保护中的确切作用仍需进一步验证。

补充这些基因组适应的是，HD03表现出独特的细胞和生理特征。作为浮霉菌门成员，它形成玫瑰花结状聚集体，这可能产生内部氧气梯度，屏蔽内部细胞免受氧化应激。结晶紫染色验证了其生物膜形成能力。这些特征增强了其对藻类表面的粘附，并促进了微氧生态位的发展。

除了固氮，HD03还表现出多种氮代谢能力。其基因组合有氨同化、硝酸盐转运蛋白以及硝酸盐/亚硝酸盐氨化作用的基因，使其能够利用无机氮源。此外，存在N-乙酰葡糖胺转运蛋白、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶和N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因，表明其具有利用有机氮的能力。这种代谢灵活性可能使HD03能够在营养可用性波动的动态海洋环境中茁壮成长。

IDENTIFICATION OF TWO DISTINCT NITROGEN-FIXING CLADES OF PLANCTOMYCETOTA IN PURE CULTURE

为确定纯培养浮霉菌门菌株中固氮潜力的普遍性和范围，研究人员进行了广泛的基因组调查。通过仔细检查来自公共数据库的142个菌株，特别关注完整的nifHDK核心基因簇的存在，成功鉴定出两个具有完整固氮能力的独特浮霉菌门支系。

Rhodopirellula支系包括五个菌株，包括Crateriforma conspicua Mal65^T和HD03，均属于Crateriforma属。这些菌株以形成生物膜和显示玫瑰花结状聚集模式为特征。Rhodopirellula_A支系包含三个属于Novipirellula属的菌株。尽管在遗传上与Crateriforma菌株不同，但它们共享保守的nifHDK簇。

值得注意的是，来自塔拉海洋（Tara Oceans）远征的全球宏基因组数据揭示了一个第三个、未培养的支系：Phycisphaeraceae_UBA7800。该支系在表层海洋中与0.22–1.6/3 μm颗粒相关的固氮群落中占主导地位。系统发育分析表明，两个可培养支系（Crateriforma和Novipirellula）是独立的谱系，与未培养的Phycisphaeraceae支系不同。这种分化凸显了浮霉菌门内固氮作用的分布和进化路径的多样性。虽然这些谱系的固氮功能验证尚待进行，但HD03的实验确定的固氮性为这些支系的固氮能力提供了推论支持。

CIRCADIAN RHYTHM OF NITROGEN FIXATION IN PLANCTOMYCETOTA WITHIN ALGAL ENVIRONMENTS

一个值得注意的发现是，上述许多可培养的固氮浮霉菌门菌株来源于大型藻类环境。这些发现强烈暗示藻类环境可能是固氮浮霉菌门的关键生态位。这种生态关联可能支撑了一种互利关系。浮霉菌门将大气氮转化为生物可利用形式，为藻类提供重要营养。作为回报，藻类释放有机渗出物，作为浮霉菌门的碳和能量底物。此外，浮霉菌门在藻类表面形成的生物膜创造了微氧微生境，保护氧敏感的固氮酶免于失活。

考虑到藻类的昼夜光合作用周期调节氧气和营养动态，研究人员调查了HD03在藻类环境中24小时的nifH基因表达过程。建立了HD03菌株与海带（Saccharina japonica）的共培养系统，并施以12小时光/暗循环，模拟自然光周期条件。氧气分析揭示了明显的昼夜波动：在暗期，氧气浓度降至6.7 mg/L，创造了有利于固氮酶活性的微氧条件；而在光期，光合作用活动将氧气水平提升至14 mg/L，表明是完全有氧条件。显著的是，nifH基因的相对表达仅在暗期被检测到，与降低的氧胁迫相一致。相比之下，在没有海带的HD03单培养中，未观察到DO和相对nifH表达的明显规律波动。这种基因表达的昼夜模式代表了浮霉菌门使其固氮作用与藻类光合作用同步的另一种机制，类似于蓝细菌中记载的时间分离策略。此外，HD03在暗-光界面表现出升高的固氮酶活性，这与热泉微生物垫中固氮酶活性在傍晚和清晨达到峰值的观察一致。值得注意的是，尽管菌株HD03具备耐氧固氮能力，但它主要在低氧的夜间进行此过程。这种看似矛盾的行为可能代表了对其藻类栖息地的适应。首先，这可能归因于该菌株的能量分配需求：尽管HD03可以在高氧条件下固氮，但氧胁迫下的固氮调节过程经验上是能量密集的。固氮的时间分离最大限度地减少了氧气对固氮酶的抑制，并保存了细胞能量，平衡了耐受性与代谢效率。此外，应注意到白天条件对固氮的复杂影响。藻类光合作用引入了影响固氮的复杂因素，例如光合代谢物。这些物质与光合产氧相结合，可能对浮霉菌门的固氮产生复杂的调节效应，这值得进一步深入研究。应当承认，共培养中为维持藻类而添加的过量硝酸盐可能影响了HD03的代谢，这表明在贫营养条件下藻类与固氮细菌的相互作用可能遵循不同的模式。未来的环境调查应优先考虑固氮微生物的夜间宏转录组取样以及固氮速率的测量，以捕捉昼夜动态。

总之，对菌株HD03固氮特性的表征，结合nifHDK基因簇在浮霉菌门中的广泛分布，牢固地确立了该门类在海洋氮输入中作为一个先前未被充分认识的关键基石。未来的研究应侧重于未培养浮霉菌门支系的功能验证和耐氧机制的机理研究，这可能为增强营养受限海洋生态系统中的氮供应提供见解。