插管儿童呼吸道微生物组随时间动态图谱：机遇性病原体定植与抗生素管理的临床意义

《Microbiology Spectrum》：Mapping the respiratory microbiome in intubated children over time

本综述深入探讨了插管儿童呼吸道微生物组的动态变化，揭示了机遇性病原体定植的普遍性及其与经验性抗生素使用之间的复杂关系。研究通过纵向采集气管吸引物（TA），结合16S rDNA测序和传统培养方法，强调了患者个体差异是微生物组构成的主要决定因素，而临床分类和插管时间影响不显著。这为优化儿科重症监护室（PICU）的抗生素管理策略提供了重要见解。

　　

ABSTRACT

儿童在接受气道插管时，几乎总是会根据临床微生物学结果使用经验性抗生素。由于潜在机遇性病原体的频繁存在，无论其是否引起疾病，病原体阳性结果几乎不可避免。这种模式导致了潜在的抗生素过度使用，对不需要抗生素的患者和抗菌药物管理目标均造成损害。为了评估我们的假设，即机遇性病原体在既往有肺部疾病的儿童中更为常见，我们前瞻性地分析了有和无既往肺部疾病儿童的气管吸引物（TA）微生物组样本。研究获得了IRB批准，并纵向收集了TA样本。样本通过16S rDNA测序和传统培养进行分析。通过电子病历获取患者人口统计学和临床病程数据。共纳入13名受试者，产生39份TA样本。微生物组分析鉴定出98个细菌属，以假单胞菌属（Pseudomonas）和链球菌属（Streptococcus）为主。患者身份是TA样本变异的重要决定因素，表明尽管存在大量抗生素暴露，个体TA微生物组仍然稳定。相比之下，在存在显著患者间差异的情况下，临床类别和插管后时间并非显著预测因子。我们的结果揭示了TA微生物组结构中存在显著的患者间差异，这限制了我们检验临床类别对微生物组结构显著影响的能力。这些结果为设计更大规模的研究提供了信息，以评估临床病史和特定类群在危重儿童抗生素与病原体动态相互作用中的作用。

IMPORTANCE

临床医生经常为疑似呼吸道感染的危重插管儿童开具经验性抗生素，这导致了抗生素的过度使用，并对抗菌药物管理提出了挑战。我们对气管吸引物培养和16S rDNA测序的纵向分析揭示了显著的患者间变异性，无论插管的主要原因如何。我们观察到临床微生物学与测序结果之间的一致性和差异性——革兰氏阴性菌在两种方法中吻合良好，而链球菌属（Streptococcus）在39份样本中的34份通过16S rDNA检测到，但仅通过培养检测到一次。我们的发现强调了在儿科患者中进行纵向气道微生物组分析的价值。鉴于儿科重症监护中病理学的异质性和年龄组的多样性，未来的大规模研究应考虑抗生素暴露、共生细菌相互作用以及影响微生物组动态的临床状况。扩大这一领域的研究可以增进我们对危重儿童微生物转变的理解，并为更精准的治疗策略提供信息。

INTRODUCTION

当儿童需要气道插管时，他们通常会在等待培养依赖性微生物学结果的同时开始使用经验性抗生素。然而，由于肺部和呼吸道的多微生物性质，临床微生物学常常回报定植阳性的结果，其中经常检测到机遇性病原体，无论其是否在活动性感染中起作用。这种模式导致了抗生素的过度处方，这不仅使患者暴露于不必要的治疗，也破坏了抗菌药物管理的努力。过度的抗生素使用带来显著风险，包括成本增加、潜在的不良反应（如肾毒性）以及促进抗生素耐药性。尽管存在这些担忧，临床医生经常根据临床表现和实验室发现启动经验性抗生素治疗，特别是在因疑似呼吸道感染而需要插管的危重儿童中。

像任何群落一样，下呼吸道微生物组是由基本的生物地理生态过程塑造的，包括迁移（微量误吸）、迁出（咳嗽、打喷嚏）以及差异繁殖和生存。然而，一旦患者被插管，这些过程的平衡就会改变。由于气管插管（ETT）提供了从口腔到下呼吸道的直接通道，误吸可能会增加，允许口腔和胃分泌物进入肺部。此外，大多数儿童需要镇静，在某些情况下还需要神经肌肉阻滞，以确保在急性呼吸衰竭期间ETT安全舒适地留在原位。这些医疗干预措施会损害自然防御机制，并可能改变宿主免疫反应，降低抵抗感染的能力。最近，定植“开花”（blooming）的概念被提出，其中宿主因素，如急性病毒感染、医疗治疗和营养可用性，有助于生物膜分散。这种向浮游状态的转变增加了细菌的毒力和感染潜力。最后，广谱抗生素在儿科重症监护室（PICU）的插管患者中很常见。这种针对定植微生物群的选择性压力通过偏爱具有特定耐药谱的物种来改变微生物组成，进一步塑造呼吸道微生物组。

获取下呼吸道（LRT）微生物组分析样本具有挑战性，因为存在样本污染的风险。“金标准”直接采样方法（组织活检和支气管镜检查）因其侵入性而受到限制，并且通常仅在直接临床需要时进行。鉴于这些直接采样的侵入性，大多数插管儿童的LRT微生物组分析依赖于分析气管吸引（通过ETT）的分泌物。使用TA分析，Tsitsiklis等人发现，68%无LRT感染的儿童存在潜在致病微生物的偶然携带。一项纵向微生物组研究得出结论，在呼吸机相关感染中，微生物组因素（如细菌负荷和优势类群）随时间的变化很小。然而，另一项研究得出结论，随着插管时间的延长，α多样性降低，感染风险增加。

鉴于这些先前的工作，我们试图根据导致插管的主要临床表现，对三个不同临床类别儿童的TA微生物组进行纵向表征：（A）患有原发性肺部病理的儿童（包括肺炎、细支气管炎、肺出血和急性呼吸窘迫综合征）；（B）患有预先存在的非肺部器官受累或“全身性疾病”的儿童（例如，肝功能障碍、心脏病因和脓毒症）；（C）没有既往肺部和/或其他全身器官疾病或所谓的“既往健康”但需要插管的儿童（例如，没有直接肺创伤的精神状态改变的外伤受害者、无肺部感染的肌无力患者，或需要插管的手术镇静）。我们假设，由于先前屏障功能缺陷，既往有肺损伤的儿童会有更高的机遇性病原体定植率。

RESULTS

Demographics

共筛查了15名受试者，入组13名，他们在平均5天的插管期间提供了36份TA（平均每名受试者2.8份TA），产生了36份传统培养物和39份用于16S rDNA测序的样本。基因组浓度低于每毫升TA 10⁴的样本被报告为低于检测限（BDL）。导致插管的主要诊断分为三组：“原发性肺部”病因组（类别A，N = 5, 38%）；非肺部“全身性疾病”组（类别B，N = 3, 23%）；以及被视为无既往肺或其他全身器官疾病但因急性疾病需要插管的“既往健康”肺组（类别C，N = 5, 38%）。类别A包括病毒性细支气管炎、坏死性肺炎、肺出血、社区获得性肺炎和急性呼吸窘迫综合征。所有类别A患者均患有急性呼吸道疾病，其中一名患者有早产引起的慢性肺病。类别B被诊断为脓毒性休克、肝病和心脏骤停。一名患有慢性肺部疾病（控制良好的哮喘）的患者以急性肝衰竭为主要病因，因此被归类为B类。类别C肺部相对健康，因神经肌肉疾病或为保护气道而插管（用于精神状态改变或无肺损伤的创伤）。

除两名患者外，所有患者都有不止一次样本采集。入组受试者的中位年龄为1.8岁（IQR 1.2-10.8），呈双峰分布，且男性占优势。在入组期间，我们没有2-5岁的受试者。除三名受试者外，所有受试者在插管时或之前都接受了抗生素治疗。

Culture-dependent analysis

我们使用标准的医院程序对36份培养物进行了细菌和真菌分析。传统培养鉴定在CHOA临床微生物学实验室使用常规机构实践进行。

在我们获得的所有培养物中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和酵母菌最常被鉴定出来，其次是卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）和流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。大约一半的初始培养物显示无生长（46%），而两份培养物对卡他莫拉菌呈阳性。在一名有神经系统合并症的受试者（患者P8）中观察到随时间推移持续存在的铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌生长。

16S rDNA profiling of TA microbiome

16S rDNA扩增子测序在39个样本和98个属中产生了635,941.2个映射读数。图1展示了按患者（面板）和采样时间点（x轴）组织的微生物组样本的组成结构。在所有39个样本中，最普遍的类群（存在定义为相对丰度>1%）是链球菌属（Streptococcus）（存在于34/39个样本中）、普雷沃菌属（Prevotella）（30/39）、韦荣球菌属（Veillonella）（25/39）、嗜血杆菌属（Haemophilus）（24/39）和假单胞菌属（Pseudomonas）（21/39）。个体患者显示出多种优势类群（在至少一个时间点相对丰度超过50%的类群），包括莫拉克斯菌属（Moraxella）（患者P3和P7）、假单胞菌属（Pseudomonas）（患者P4、P8和P17）和链球菌属（Streptococcus）（患者P5、P9、P12和P16），表明微生物组结构存在显著的患者间变异性。线性混合效应模型显示，不同疾病类型和时间之间的α多样性差异不显著。

为了开始探索这种变异，我们接下来将图1中的数据重新绘制为使用主坐标分析（PCoA）的微生物组聚类二维排序图。按个体患者着色的PCoA显示按患者存在显著聚类（PERMANOVA, F = 1.751, P = 0.003）。然而，按临床类别（F = 1.527, P = 0.106）或插管持续时间（F = 1.926, P = 0.079）的聚类不显著。鉴于在群落尺度上缺乏按临床类别的差异，我们接下来谨慎地推进我们的初始假设，即在有既往肺损伤的儿童中机遇性病原体增加。我们的16S rDNA分析揭示了几类可能包含明确呼吸道病原菌的类群（莫拉克斯菌属、假单胞菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属和链球菌属）。我们注意到，其中一些属也包含大量纯共生物种（特别是链球菌属）。为了限制统计效力的损失，我们因此将统计检验集中在假单胞菌属，因为这是我们的最常见属之一，并且我们有更高的信心认为该属中的读数与已确定的机遇性病原菌物种铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）相关。我们的统计分析显示所有诊断类别之间铜绿假单胞菌相对丰度存在显著差异（Kruskal-Wallis chi-squared = 7.4531, df = 2, P = 0.02408），但在原发性肺病和既往健康（类别A和C，Dunn检验，P = 0.0723）、全身性疾病和既往健康（类别B和C，Dunn检验，P = 0.0638）以及原发性肺病和全身性疾病（类别A和B，Dunn检验，P = 1.000）的个体类别比较中，丰度没有差异。患者3和16在第一个样本中显示出相对较高的莫拉克斯菌属和假单胞菌属丰度，尽管接受了抗生素治疗。

DISCUSSION

这项初步监测研究强调了插管儿童气管吸引物（TA）微生物组的显著变异性，大部分变异可归因于个体患者差异。由于观察到的患者间异质性和小样本量，我们的研究缺乏统计效力来检验我们关于在有既往肺损伤的儿童中存在独特的、富含病原体的TA微生物组的主要假设。主坐标分析（PCoA）排序和PERMANOVA显示没有与主要诊断或插管持续时间相关的明确微生物组模式。这些发现与先前关于呼吸机相关感染的研究一致。

我们的研究仅通过16S测序评估细菌丰度；因此，真核生物（如酵母菌）或病毒的存在或丰度未通过分子方法确定。最近，细菌定植“开花”已在急性病毒感染的背景下被描述，其中预先存在的生物膜相关定植者分散成浮游状态，增加了它们的致病潜力。与生物膜不同，生物膜即使在高浓度下也表现出显著的抗生素耐药性，而浮游细菌通常对抗菌治疗更敏感。

我们承认我们的研究无法评估细菌感染与潜在病毒共感染之间的相互作用。然而，在我们的研究样本的一些细菌培养物中检测到酵母菌的存在。越来越多的证据表明，鼻腔或上呼吸道的细菌定植者可以在特定条件下转变为真正的病原体。这一知识空白尤其相关，因为我们队列中广泛使用的广谱抗生素可能通过抑制共生微生物群落而促进了酵母菌的过度生长。未来的研究将真核生物和病毒的更广泛分析与细菌分析相结合，可能为气道微生物群从健康到疾病的时间演变带来新的见解。我们的研究还强调了临床微生物学报告与16S rDNA结果之间的一致性和差异性。虽然革兰氏阴性菌在培养鉴定和16S rDNA分析之间显示出普遍一致性（两种方法在五名患者中检测到相同的微生物），但也观察到一些差异。例如，临床培养仅在插管当天从患者05检测到链球菌属，而16S rDNA测序在39份样本中的34份鉴定出链球菌属。这种差异可能源于临床微生物学专注于培养致病性链球菌，而16S rRNA测序捕获了广泛的共生链球菌物种多样性。在比较龋齿和下呼吸道感染中基于培养和基于测序的诊断方法的研究中报道了类似的发现，表明从定植到疾病的转变涉及微生物群落与环境因素之间的复杂相互作用。因此，应谨慎解释定植与疾病之间的关联。在15份被临床微生物学报告为“无生长”的样本中观察到更广泛的不一致，但这些样本通过16S rRNA测序显示出多样化的细菌微生物组。这可能反映了基于测序的方法能够检测到超出常规临床培养方法范围的共生生物。虽然许多微生物组研究仅提供健康和疾病中微生物群落的横断面快照，但我们的研究有助于理解同一队列内微生物组的纵向变化。

我们承认我们的研究除了其以细菌为中心的重点外，还有几个局限性。首先，缺乏真正的“健康”队列是一个挑战，因为伦理问题阻止了仅为研究目的对健康儿童进行插管。作为替代，我们假设类别C（既往健康儿童）最能近似非病变的肺部环境。然而，这一假设仍然是理论上的，并未在我们的研究中直接验证。其次，小样本量进一步分散在不同的诊断类别中，限制了我们发现组间显著差异的能力。此外，由于样本量有限，未能调整多种临床因素，如氧气含量和输送、细菌营养可用性、温度波动和宿主免疫反应。这些变量可能影响微生物组生态，特别是细菌生长动态。对更大队列和改善临床变量统计控制的进一步研究可能为预先存在的肺部疾病对肺部感染易感性微生物动态的影响提供更深入的见解。

Conclusions

我们的结果揭示了TA微生物组组成的显著患者间变异性，这掩盖了临床类别之间的差异。鉴于这种变异性，我们无法检测到组间显著的微生物组差异。通过表征纵向患者间变异，我们的研究为设计未来更大规模的研究奠定了基础，旨在识别与插管儿科患者特定临床状况相关的微生物组特征。

MATERIALS AND METHODS

Study design, setting, and participants

我们在美国一家拥有36张床位的四级护理中心PICU进行了一项单中心前瞻性队列研究，该PICU年平均入院人数为2,800人。我们招募了符合纳入标准的受试者。

纳入标准为（1）可能需要机械通气>48小时的插管儿童和（2）年龄0至21岁。排除标准为（1）可能在24-48小时内拔管和（2）存在经ETT吸痰的禁忌症或更高风险，如术后气道重建。所有人口统计学特征、病史和急性疾病细节均在住院期间收集，所有培养结果均从电子病历中获取。

Specimen collection

初始TA在插管后24小时内收集，随后在接下来的周一、周三和周五收集，持续到拔管或满14天（以先到者为准）。TA的收集按照ICU常规实践进行，使用新的无菌、尺寸合适的在线吸痰导管（Halyard, Alpharetta, GA），该导管连接到Lukens标本收集器（Cardinal Health, Dublin, OH），力求每次吸痰最好在每天早晨进行。每次样本收集均使用新更换的在线导管进行，以尽量减少污染。还将1毫升无菌生理盐水通过导管吸入Lukens收集器中，剩余的生理盐水保存用作16S rDNA测序的阴性对照。所有样本立即转移到亚特兰大儿童医疗保健中心（CHOA）的临床微生物学实验室，分装到冷冻管中，并在-80°C冷冻保存，直至在佐治亚理工学院（GA Tech）的Brown实验室进行DNA制备。

传统培养鉴定在CHOA临床微生物学实验室使用常规机构实践进行。简而言之，将TA接种到血琼脂、巧克力琼脂、麦康凯琼脂、CNA和厌氧培养基上，划四区。然后，平板在34–37°C、CO₂条件下培养，厌氧培养在34–37°C厌氧条件下进行。从标本的脓性部分制备涂片用于革兰氏染色。如果每个低倍视野（10倍物镜）显示超过10个鳞状上皮细胞（SECs），则标本被拒收。鉴定可能的病原体，包括肠杆菌科、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和其他非发酵革兰氏阴性杆菌、真菌（包括酵母菌）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）。平板培养18-24小时，并在24和48小时观察。根据需要将分离物传代培养到血琼脂、巧克力琼脂或麦康凯琼脂上，以便从混合培养物中分离，并在适当时进行药敏试验。由CHOA实验室的临床微生物学家通过检查存在的细菌数量和类型来解释培养结果。

16S rDNA sequencing and compositional analysis

使用Qiagen Power Soil Pro试剂盒（Qiagen Inc., Germantown, MD, USA）分离基因组DNA。文库制备和测序由Swift Bioscience（Ann Arbor, MI, USA）进行。简而言之，使用Swift Normalase Amplicon Panel生成文库，该Panel靶向细菌16S rDNA序列的所有九个可变区，并进行Illumina测序。使用Swift Biosciences的16S-SNAPP管道处理产生的原始测序读数，使用默认参数，但读长截断值除外（正向序列230 bp，反向序列180 bp）。该处理管道使用Cutadapt去除接头，然后在连接配对末端之前进行质量过滤和去噪。使用DADA2去除嵌合体，产生扩增子序列变体（ASVs）。使用VSEARCH生成唯一序列集，并用于查询来自RDP 11.5的高一致性匹配的自定义16S数据库。对该数据库进行读数分类以生成OTU计数。然后将数据转换为PhyloSeq对象，并将读数计数转换为相对丰度。在分析β多样性之前，生成了一条稀疏曲线，表明理想的深度为每个样本7,000次读数，这将导致去除四个低读数样本。使用Adonis PERMANOVA [VEGAN]对β多样性差异进行分析，对稀疏至7,000次读数的数据和稀疏至1,800次读数（以保留所有样本）的数据进行了分析。结果在数量上是相同的，因此本文中呈现的稀疏深度为每个样本1,800次读数。数据稀疏至1,800次读数用于通过PCoA可视化β多样性，而所有其他图表呈现的是未稀疏的相对丰度。构建了一个线性混合效应模型，以疾病类型和时间作为固定效应，患者ID作为随机效应，以确定这些变量对群落多样性的影响。

我们的数据（生物项目编号：PRJNA 1289159）已上传。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究得到了亚特兰大儿童医疗保健中心重症监护创新基金的慷慨支持（KMT），疾病控制与预防中心（CDC合同75D30120C-09782，SB）和国家科学基金会的资助。

所有工作均在埃默里大学、亚特兰大儿童医疗保健中心和佐治亚理工学院完成。

这项初步研究得到了亚特兰大儿童医疗保健中心马克·冈萨雷斯博士、临床微生物学部门以及PICU呼吸治疗师的支持，并由儿科重症监护医学创新基金资助。

K.M.T.参与了设计、获得IRB批准、收集样本和临床数据、获得资金以及修改本手稿。J.F., J.V., C.Z., E.M., 和 S.B.参与了研究的建模、样本处理和分析。

S.B.获得了资金，并监督了整个项目。

所有作者都参与了手稿的修改，并阅读和批准了提交的版本。

ETHICS APPROVAL

获得了IRB批准（埃默里大学IRB协议#89008，佐治亚理工学院#H21223）。从每位入组受试者处获得了参与研究和发表的知情同意。