亚热带典型河口浮游古菌的季节动态与环境调控机制：以磷酸盐为核心驱动因子

《Microbiology Spectrum》：Seasonal dynamics and environmental controls of planktonic archaea in a typical subtropical estuary

本研究系统揭示了珠江口浮游古菌群落的季节动态及其对环境因子的响应机制，重点阐明了磷酸盐（PO43?）作为关键限制性营养盐对古菌群落组成、多样性和互作网络的调控作用，为理解古菌在河口生态系统元素循环中的适应策略及功能预测提供了重要依据。

　　

ABSTRACT

浮游古菌在从河口到沿海海域的生物地球化学循环中起着关键作用。然而，对其季节性环境波动的适应机制仍知之甚少。本研究调查了珠江口（PRE）浮游古菌群落的季节动态及其对生物和非生物因子的响应。Thermoproteota和Thermoplasmatota是两个最丰富的门，两者在夏季和冬季之间均显示出显著差异。由于磷是PRE中最限制性的营养盐，随机森林分析发现PO₄^3?具有最显著的季节变化，其次是温度和叶绿素a（Chl a）。对丰富古菌的Mantel检验显示，与磷酸盐相关的OTU数量仅次于温度，位居第二。广义加性模型（GAM）分析进一步揭示，Thermoproteota的丰度受PO₄^3?、温度和溶解氧（DO）控制，而MGII的丰度受PO₄^3?、pH、盐度和Chl a控制。我们的研究表明沿海古菌群落存在强烈的季节性，并揭示了它们的环境适应性以及预测其对区域和全球环境变化响应的生物地球化学功能改变。

INTRODUCTION

古菌广泛分布于各种自然生境中。它们在碳、氮、磷循环中的生态功能证明了其对生物地球化学过程不可或缺的影响。这些古菌不仅维持元素循环的平衡，而且在响应和适应波动的环境条件方面表现出显著的可塑性。河口等复杂动态环境中的古菌适应策略和生态影响，是一个引人注目但尚未解决的科学探究领域。珠江口是中国第二大河流系统，具有典型的亚热带季风气候，并受到自然因素和人为活动的共同影响。该区域的溶解无机氮磷比远高于Redfield比率（16:1），表明PRE存在持续的磷限制。磷酸盐浓度也表现出季节性波动，为那些浮游古菌提供了广泛的磷酸盐可用性范围，表明它们可能经历磷酸盐限制期。因此，PRE可被视为研究古菌群落对季节性动态磷酸盐条件适应机制的自然实验室。

MATERIALS AND METHODS

于2021年7月至8月（夏季）和2021年12月至2022年1月（冬季）使用采水器从站点采集表层和底层水样。使用CTD系统记录水温、盐度和溶解氧（DO）。每个点的2升水样经0.2 μm滤膜预过滤后，获得用于微生物群落分析的滤膜。使用SEAL自动分析仪系统分析溶解无机营养盐（PO₄^3?、SiO₄^2?、NO₃^?、NO₂^?和NH₄⁺）浓度。使用FastDNA Spin Kit for Soil提取滤膜上的DNA。使用古菌特异性引物Arch344F/Arch915R通过PCR扩增古菌16S rRNA基因。扩增产物在Illumina MiSeq PE300上进行高通量测序。使用fastp对原始序列进行质控，使用FLASH进行拼接，并使用QIIME2流程中的DADA2进行降噪。保留的高质量序列在97%序列相似性水平下聚类为操作分类单元（OTU）。使用R语言中的“vegan”包等进行Spearman相关性分析、随机森林分析、Mantel检验和冗余分析（RDA）。基于Spearman相关系数和P值构建共现网络，并使用Gephi进行可视化和网络拓扑指标计算。使用广义加性模型（GAM）分析古菌及主要类群丰度与环境因子的关系，模型表达式为LnY = α + s(x1) + ... + s(xn) + ε，其中Ln是连接函数，Y是响应变量，s()表示平滑函数，x是自变量，ε是误差项。使用方差膨胀因子（VIF）检验多重共线性，使用Akaike信息准则（AIC）筛选变量构建最优模型。

RESULTS

The seasonal physicochemical parameters of sampling sites

水体理化性质量化结果显示，除温度外，两个季节之间环境参数差异最显著的是PO₄^3?浓度（冬季平均值1.29 ± 0.69 μM，夏季0.4 ± 0.2 μM）、Chl a水平（冬季0.57 ± 0.18 μg/L，夏季3.52 ± 2.45 μg/L）和DO（冬季6.21 ± 0.31 mg/L，夏季4.67 ± 0.99 mg/L）。盐度和pH也表现出显著的季节性变化。其他参数如NH₄⁺、SiO₄^2?和NO₃^?在两个季节间无显著差异。

Archaeal community structure and composition

从109个水样中共鉴定出7,057个古菌OTU。古菌群落包括9个门和4个超门。OTU最丰富的是Nanoarchaeaeota，而OTU丰度最高的是Thermoproteota（55.13%）和Thermoplasmatota（28.72%）。古菌类群的相对丰度随季节变化。最丰富的门是Thermoproteota，其次是Thermoplasmatota，但Thermoproteota在冬季的丰度（68.36%）显著高于夏季（45.75%）。在纲水平，夏季的丰富度和多样性更高，以Nitrososphaeria（MGI, 45.74%）和Poseidoniia（MGII, 32.29%）为优势类群；而冬季，Nitrosopumilaceae（68.35%）在总古菌类群中占绝对优势。古菌群落结构在夏季或冬季的水层之间均无显著差异。

Alpha diversity of the archaeal communities

α多样性分析显示，夏季的丰富度指数和多样性指数均高于冬季，但仅多样性指数在夏季显著高于冬季。夏季样品的等级丰度曲线具有更广的横轴范围和更平滑的曲线形状，表明其物种丰富度更高，物种分布更均匀。

Patterns and driving factors of archaeal community composition

环境因子差异分析显示，冬季的盐度、DO、PO₄^3?和NO₂^?高于夏季，而夏季的温度、pH和Chl a浓度更高。随机森林分析表明，磷酸盐、温度和Chl a是导致季节差异的关键因子。Mantel检验显示，在相对丰度前50的古菌OTU中，与磷酸盐相关的OTU数量（12/50）仅次于温度（17/50）。在科水平，Nitrosopumilaceae（MGI）丰度显著受温度和磷酸盐影响，MGIIa丰度与温度显著相关，MGIIb与温度、盐度和Chl a显著相关。RDA分析表明，冬季样品环境以较高的DO、PO₄^3?、SiO₄^2?、NH₄⁺、NO₂^?、NO₃^?和较低的温度、Chl a、pH为特征。在纲水平，Nitrososphaeria与PO₄^3?呈显著正相关，而Thermoplasmatota（包括MGIIa, MGIIb, MGIII, MBGD, DHVEG-1）与pH呈显著正相关，与SiO₄^2?呈显著负相关。Woesearchaeia和Bathyarchaeia与温度呈显著正相关。

Co-occurrence network affecting the microbial community composition

基于Bray-Curtis距离的层次聚类分析将样品分为高盐度和低盐度组。对高盐度组样品构建的古菌共现网络显示，冬季网络（241个节点，4,380条边）比夏季网络（368个节点，2,701条边）更复杂，尽管节点数较少。冬季网络的平均路径长度更短，平均连通性更高，表明其比夏季网络更稳定和复杂。两个网络中的优势类群大致相同，四个最常出现的类群是Woesearchaeia、Bathyarchaeia、MGIIa和Nitrosopumilaceae。Bathyarchaeia、Marine Benthic Group D and DHVEG-1以及Asgardaeota更频繁地出现在冬季网络中。

Model performance and effect of the individual predictor on archaeal abundance

qPCR结果显示，冬季古菌16S rRNA基因拷贝数（6.40 × 10⁵至5.21 × 10⁸ copies L^?1）显著高于夏季（7.03 × 10³至8.07 × 10⁶ copies L^?1）。GAM模型分析显示，影响古菌丰度的最主要环境变量是PO₄^3?、温度和DO。古菌丰度随PO₄^3?和DO浓度增加而缓慢增加，随温度升高而降低。Nitrosopumilaceae的丰度变化趋势与总古菌相似。MGIIa丰度与PO₄^3?浓度、盐度和pH呈正相关；MGIIb在此基础上还与Chl a浓度呈负相关。MGIII丰度与温度、DO浓度和Chl a浓度呈负相关，与PO₄^3?浓度和pH呈正相关。Bathyarchaeia、MBGD and DHVEG-1、Methanofastidiosaceae和Asgardaeota的丰度随温度、盐度和DO浓度升高而降低。Woesearchaeia丰度与PO₄^3?浓度呈正相关，与温度和盐度呈负相关。

DISCUSSION

Seasonal variation shapes archaeal community diversity and composition

PRE的典型亚热带季风气候驱动了多样的古菌生态位。季节变化导致PRE理化参数（如温度、盐度、DO、PO₄^3?和Chl a浓度）发生显著改变。冬季PRE磷酸盐浓度较高是由于更强的海水垂直混合将沉积物中的磷酸盐悬浮起来，以及冬季大量死亡浮游植物分解将DOP转化为磷酸盐所致。夏季，淡水稀释和由于温跃层导致的水体混合不良阻止了底层磷酸盐到达表层，同时大量浮游植物对磷酸盐的利用导致其水平较低。本研究中的季节差异主要是由冬季风驱动的潮汐和淡水输入混合水造成。环境参数的变化塑造了微生物群落的组成和多样性，这是全球河口生态系统的特征。本研究证明Thermoproteota是PRE浅海海水中的主要古菌群落，其次是Thermoplasmatota。然而，古菌优势类群的分布随季节略有变化。Thermoproteota的相对丰度在冬季显著增加，主要体现为Nitrososphaeria。AOA丰度的变化可能受溶解氧等环境变化的影响，冬季样品中较高的溶解氧浓度可以刺激氨氧化过程。为了在磷酸盐限制的河口生存，AOA需要表现出更高的磷酸盐亲和力以提高磷吸收效率，这可以解释AOA在高磷酸盐的冬季具有更高丰度。MGII丰度在夏季显著增加，可能是因为其异养代谢和光捕获能力使其更可能出现在较温暖的水体中。古菌的多样性和丰富度在夏季显著高于冬季。更高的温度可以通过改变酶活性和膜转运效率来促进微生物生长和活动。由季节变化引起的环境因子季节性变化在决定古菌丰度方面比海水层和生活方式更具影响力。

The responses of archaeal communities and their abundance to abiotic factors

先前研究表明温度、盐度和营养盐浓度是塑造PRE河口古菌特定群落结构的关键因子。Mantel检验显示PO₄^3?与高丰度OTU（Nitrosopumilaceae）的相关性最显著，其次是温度和DO，暗示了PO₄^3?的关键性。在磷限制环境中，古菌增强高亲和力磷酸盐转运蛋白的表达以更有效地从环境中捕获磷酸盐。在磷充足环境中，古菌可能更多地依赖低亲和力磷酸盐转运系统以减少能量消耗。Nitrosopumilaceae属于自养古菌，能够利用氧气将铵转化为硝酸盐。AOA作为关键硝化作用限速步骤驱动因子的高丰度分布，暗示了低磷酸盐利用和高硝化速率是对PRE水体中磷限制的适应性反应。此外，一些异养古菌与温度、pH和盐度强烈相关，这些因子也影响本研究中Thermoplasmatota的生长。环境因子和古菌组成在RDA中也表现出清晰的季节分布。随机森林显示磷酸盐对季节变化的影响最显著，其次是温度和Chl a。亚热带河口可能表现出强烈的环境条件季节性变化，古菌可能对环境变化有相似的生态响应，使其能够占据特定的生态位。季节变化导致优势类群转变，河口AOA在寒冷季节比AOB更具适应性和更强功能。总体而言，温度、PO₄^3?、DO和pH可能是导致PRE古菌群落季节变化的主要因子。

GAM模型揭示PO₄^3?是影响这些优势古菌丰度的最有力环境因子。本研究中冬季海水磷酸盐浓度显著高于夏季，这可能是由于夏季高降雨导致的高径流稀释效应所致。基于Deutsch的N*评估Redfield比率的偏差表明，与夏季相比，冬季的磷限制程度有所缓解。AOA在冬季具有最高的拷贝数，可能拥有独特的磷获取机制，使其能够在磷限制环境中生存和适应。几项研究证实了在AOA的MAGs中存在高亲和力磷酸盐转运蛋白、无机磷依赖性调节因子或多聚磷酸盐利用基因，使其能够获取周围海水环境中的磷。与低磷酸盐海水相比，AOA在高磷酸盐环境中利用磷酸盐转运能力更容易捕获磷酸盐，这也与本研究中AOA在高磷酸盐环境的冬季具有更高丰度一致。这一现象表明Nitrosopumilaceae倾向于在磷酸盐生物利用度高的环境中占主导地位。与Nitrosopumilaceae类似，本研究发现MGIIa和MGIIb均与磷酸盐呈正相关。MGII在PRE的丰度优势可能与其特殊的磷酸盐限制环境有关。与其他环境中的MGII相比，PRE的MGII具有高N:P比，含有高亲和力磷酸盐转运蛋白，因此可能更具竞争性，表明磷酸盐对MGII的显著影响。

研究指出氧气在控制海洋AOA的分布和活性方面至关重要。本研究结果同样表明AOA可以在更广泛的DO浓度范围内生活，这是其对环境适应的一个标志。较温暖的海水吸收的氧气较少，异养古菌可能更喜欢生活在营养丰富、低氧的环境中。温度直接影响古菌的代谢活动以及大多数生化途径。作为PRE中的优势目，Nitrosopumilaceae的丰度在温度低于20°C时增加，但在温度升至20°C以上时逐渐降低，这也解释了它们在较冷冬季月份丰度更高的原因。

本研究显示MGIIb丰度随盐度增加呈上升趋势，并在盐度高于25 PSU时该趋势减弱。通常，MGIIb大多在贫营养和高盐海水中被检测到。MGII丰度与盐度的强相关性可能源于其半咸水起源及其在不同盐度水环境中的演化。此外，盐度是影响异养古菌丰度的主要因素之一。这种影响取决于不同的亚群。

MGIIb和MGIII是本研究中唯一与Chl a呈负相关的类群，这可以解释为其广泛存在于低叶绿素的深海中。MGIII在低温和低溶解氧环境中也更普遍。

有趣的是，本研究的模型显示古菌丰度与铵盐没有关联，这可能与PRE特殊的生态系统有关。PRE中氮的高流动性和多来源导致其氮增长率高于磷。此外，无机氮以硝酸盐为主，其次是亚硝酸盐，氨盐最低，因此PRE表层水中的古菌丰度受铵盐影响较小。

Deciphering archaeal interactions with co-occurrence networks

共现网络揭示了微生物群落内复杂的相互作用。先前研究报道了古菌与细菌和真核生物的共存，而地理纬度和季节影响河口古菌群落的复杂性和稳定性。本研究中，正相关关联在古菌共现网络中占主导地位，表明古菌之间存在潜在的共生关系。尽管夏季节点更多，但冬季共现网络具有更多的连接，这表明冬季网络更复杂。

Bathyarchaeia和Asgardaeota是冬季高混合海水中的关键类群，在冬季网络中关系密切，表明它们喜欢在贫营养环境中共生。Bathyarchaeota参与有机质矿化、产乙酸、产甲烷、尿素生成等过程。反过来，Asgard可以利用其产物进行生化过程，这有助于它们的合作或共生关系。此外，Bathyarchaeia和Thermoplasmatota的成员经常在多种环境中共同出现。它们在本研究中较高的节点数和连通性证明了它们在维持网络稳定性中的重要作用。夏季微生物更容易获得营养盐，古菌不需要更多的共生关系来获取有机物。这可以解释为什么Thermoplasmatota、Bathyarchaeia和Woesearchaeia在夏季有更多的节点和连接，但连接数较少。

作为最丰富的古菌类群，Nitrososphaeria在冬季或夏季的共现网络中均不占主导地位，这与先前研究不同。同时，Nitrososphaeria在共现网络中与其他物种连接不紧密，暗示其群落结构受生物因子影响不大。这表明古菌的丰度和共现特征不一定同步。尽管季节变化对古菌主要类群不显著，但它们改变了群落间的平均连通性。总体而言，网络拓扑结构指向一个在冬季连接更紧密、更复杂的古菌群落，并且对外部环境干扰更稳定。

Conclusions

对古菌群落时空分布模式的综合调查表明，Thermoproteota和Thermoplasmatota门主导了古菌群落组合。显著的季节波动显著影响了这些古菌的分布动态和群落结构。非生物因子的季节变化，特别是磷酸盐、DO、pH、盐度和Chl a浓度，在控制丰富古菌如Nitrosopumilaceae、MGIIa和MGIIb的丰度方面起着关键作用。共现网络显示冬季的古菌群落比夏季连接更紧密、更复杂，表明了生物因子在塑造古菌群落中的重要性。总之，本研究展示了这些沿海古菌对动态磷酸盐浓度的适应，并为预测其在全球环境变化背景下的潜在变化和生物地球化学功能提供了见解。