脑膜炎奈瑟菌通过甲基柠檬酸循环在特定条件下利用丙酸毒性及α-酮丁酸代谢的机制研究

《Microbiology Spectrum》：Propionic acid toxicity and utilization of α-ketobutyric acid in Neisseria meningitidis via the methylcitrate cycle under specific conditions

本研究揭示了脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）甲基柠檬酸循环（MCC）在宿主微环境适应中的新功能。作者发现丙酸（propionate）毒性效应受主要碳源调控，并鉴定出位于prp操纵子内的新型α-酮丁酸（α-ketobutyrate）转运蛋白KbuT（TSUP家族），该发现拓展了我们对病原体代谢适应机制的理解，为侵袭性脑膜炎的发病机制提供了新视角。

　　

ABSTRACT

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）是人类鼻咽部的特异性暂驻菌，偶尔引起侵袭性疾病。该菌能利用有限范围的化合物作为主要碳源，包括葡萄糖、麦芽糖、乳酸和丙酮酸，这些碳源在与其感染相关的微环境中浓度各异。此外，三羧酸循环（TCA cycle）中间体如琥珀酸、富马酸和苹果酸，以及谷氨酸等氨基酸也被用作补充碳源。值得注意的是，脑膜炎奈瑟菌还拥有一个功能性的甲基柠檬酸循环（MCC），使其能够同化丙酸并减轻其毒性。

INTRODUCTION

特定微生物在宿主体内占据特定生态位的能力，无论是否引起侵袭性疾病，都受多种因素调控，包括其代谢能力。对于奈瑟菌物种而言，其共生和致病行为的一个关键因素是在人类宿主不同微环境中获取生存必需营养的能力。脑膜炎奈瑟菌只能利用少数碳源，包括两种碳水化合物麦芽糖和葡萄糖、乳酸以及少数氨基酸如谷氨酸。此外，丙酮酸和TCA循环中间体琥珀酸、富马酸和苹果酸也能被脑膜炎球菌同化和分解代谢。

乳酸通过乳酸通透酶LctP转运进入脑膜炎球菌，其代谢由至少三种乳酸脱氢酶完成。乳酸通过氧化为丙酮酸为电子传递链提供电子，从而为生长提供能量。丙酮酸随后生成乙酰辅酶A（脂肪酸合成的前体）以及在此生长条件下完全功能的TCA循环的组成成分和产物。

与许多细菌利用磷酸转移酶系统高效转运葡萄糖不同，脑膜炎球菌通过离子同向转运通透酶GluP转运葡萄糖。在脑膜炎球菌中，葡萄糖主要通过Entner-Doudoroff途径代谢，产生相对较少的能量，戊糖磷酸途径贡献较小。在中性pH值下，葡萄糖的分解代谢导致乙酸盐积累，直到葡萄糖耗尽或生长受限时才被进一步分解代谢。事实上，在淋球菌和脑膜炎球菌中，葡萄糖上的生长显著降低了TCA循环酶的水平。为了维持有氧代谢，TCA循环的活性可能由TCA循环中间体琥珀酸、富马酸、苹果酸和α-酮戊二酸支持，以及可由谷氨酸直接转化为α-酮戊二酸。

这些碳源生化途径及相关调控机制具有更广泛的意义，因为在与脑膜炎球菌感染相关的微环境中，葡萄糖、乳酸、丙酮酸和谷氨酸的比例差异很大。葡萄糖是血液中的主要碳源；相比之下，乳酸是脑脊液中的主要碳源，同样在唾液以及定植有乳酸菌的黏膜环境（如口咽和鼻咽）中也是如此。乳酸和丙酮酸往往在吞噬细胞内被用作主要碳（能量）源。谷氨酸可能在细胞内环境和脑脊液中代表重要的碳（和氮）源，在脑膜炎期间脑脊液中该氨基酸水平强烈增加并与疾病严重程度相关。L-谷氨酸的摄取被认为在细胞和动物感染模型中对脑膜炎球菌感染至关重要，并且在预防氧化损伤方面也起作用，因为L-谷氨酸是谷胱甘肽的前体。最后，没有证据表明脑膜炎球菌可以利用葡萄糖-6-磷酸（细胞内环境中可用的碳源），如同其他致病菌那样。

一个基因组岛使得脑膜炎奈瑟菌能够在营养贫乏的生长条件下通过甲基柠檬酸循环（MCC）利用丙酸，并克服丙酸的毒性。该基因组岛在N. lactamica中缺失，这将赋予脑膜炎奈瑟菌在年轻人中相对于N. lactamica的选择性优势。事实上，N. lactamica和N. meningitidis具有与年龄相关的定植模式，并且观察到在年轻人的咽部，脑膜炎球菌携带率的增加与产生丙酸的细菌丰度的增加相关。这种有机酸对许多微生物有毒，但可以被脑膜炎奈瑟菌用作额外的碳源，而N. lactamica则不能。

这些前提引导我们研究脑膜炎球菌中与丙酸毒性相关的某些方面，与其生长所用主要碳源的关系，并探索MCC在该微生物中的新可能功能，例如利用α-酮丁酸，这是一种在脑膜炎球菌和受感染宿主细胞许多代谢通路交汇处的α-酮酸。它涉及多种氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸）的代谢，并在丙酸代谢和C-5支链二元酸代谢中发挥作用。

RESULTS

不同主要碳源下脑膜炎球菌对丙酸的生长抑制依赖性

为了研究MCC在不同生长条件下的作用，通过pDE△prpB或pDE△prpC分别插入失活prpB（编码2-甲基异柠檬酸裂解酶；MC58菌株中的NMB430）或prpC（编码2-甲基柠檬酸合酶；MC58菌株中的NMB431），并进行了遗传互补。通过测定600 nm光密度（OD_{600 nm}）评估在不同培养基中生长的细菌的生长曲线。

在无丙酸存在下，当以葡萄糖、丙酮酸或乳酸作为主要碳源在脑膜炎球菌确定培养基（MCDA）中生长时，prpB和prpC缺陷突变体的行为与野生型菌株相似。相反，当向MCDA-葡萄糖或MCDA-丙酮酸中添加1 mM丙酸时，突变体的生长受到抑制，而野生型菌株和prpB、prpC互补菌株则不受抑制，而所有菌株在含有1 mM丙酸的MCDA-乳酸中均能生长。此外，与先前发现一致，我们发现在含有亚抑制浓度丙酸的MCDA-丙酮酸中，野生型菌株的最终生物量增加。在5 mM丙酸下，所有三种菌株在MCDA-葡萄糖或MCDA-丙酮酸中均不生长，而在MCDA-乳酸中它们能够生长，并且出乎意料的是，在这种培养基中，野生型菌株的生长似乎比prpB和prpC缺陷突变体受到轻微抑制，在10 mM丙酸存在下更是如此。这一结果表明，在葡萄糖上生长的细菌的丙酸抑制机制与在以乳酸为主要碳源生长的细菌中不同。

评估在MCDA-葡萄糖或MCDA-丙酮酸中生长、存在或不存在5 mM丙酸的脑膜炎奈瑟菌B1940的菌落形成单位（CFU）表明，丙酸并不杀死细菌，而只是阻止其生长，因为在添加丙酸的培养基中，初始接种物的CFU数量在长达12小时内几乎保持稳定。

如前所述，在MCDA-葡萄糖或MCDA-丙酮酸中，野生型菌株B1940和prpB、prpC缺陷突变体在5 mM丙酸存在下的生长被完全抑制。然而，先前研究表明，野生型MC58菌株和prpC缺陷同基因突变体在另一种化学成分确定的培养基（称为CDM）中，在5 mM丙酸存在下均能以葡萄糖或丙酮酸生长。我们假设这种差异可能是由于MCDA和CDM化学成分的差异所致。CDM和MCDA之间的主要区别如下：CDM中存在L-谷氨酰胺（4 mM）而非MCDA中的L-谷氨酸（8 mM）；CDM中的L-丝氨酸浓度（4.75 mM）高于MCDA（0.2 mM）；CDM中存在高浓度的L-胱氨酸（3.8 mM）而非MCDA中的低浓度L-半胱氨酸（0.06 mM）；仅CDM中含有NaHCO₃（10 mM）。为了理解这些差异中哪些可能影响丙酸存在下的生长，通过逐一添加3.8 mM L-半胱氨酸、4 mM L-谷氨酰胺、4.75 mM L-丝氨酸或10 mM NaHCO₃来修改MCDA培养基。然后分析野生型菌株B1940在修改后的培养基中、存在5 mM丙酸、以葡萄糖为主要碳源时的生长。我们发现，仅当培养基补充了10 mM NaHCO₃时，该菌株才能在含有5 mM丙酸的MCDA-葡萄糖中生长。在这种修改后的培养基中，缺陷突变体prpB和prpC也能生长，而在含有5 mM丙酸和10 mM NaHCO₃的MCDA-丙酮酸中，只有野生型菌株能生长，突变体则不能。这些结果证明NaHCO₃能够减弱丙酸对生长的抑制。

不同主要碳源导致丙酸生长抑制的 distinct 机制

丙酸毒性归因于许多不同机制，包括丙酸本身导致的非特异性机制，如细胞内pH降低、阴离子积累和质子动势耗散，以及由丙酰辅酶A积累导致的特异性机制。丙酰辅酶A是细菌和真菌系统中丙酮酸脱氢酶的公认抑制剂；它是柠檬酸合酶的竞争性抑制剂，并且在鼠伤寒沙门氏菌中，它可以是柠檬酸合酶的底物，导致产生有毒的2-甲基柠檬酸异构体（非由甲基柠檬酸合酶产生），该异构体抑制糖异生中的关键酶果糖-1,6-二磷酸酶。其他研究还表明，高丙酸浓度的抑制效应可能部分由2-甲基异柠檬酸积累抑制NADP依赖的异柠檬酸脱氢酶引起，例如在构巢曲霉中；TCA循环和糖异生途径中草酰乙酸的耗竭；以及由于同型半胱氨酸积累导致的硫醇代谢改变。事实上，硫醇（谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸）、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通过O-琥珀酰-L-高丝氨酸代谢节点与MCC相连。最近，丙酸已被证明可灭活丙氨酸消旋酶，导致Serratia marcescens中Rcs应激反应系统的激活。

为了剖析这些不同机制，我们构建了一个ackA2缺陷突变体，其在丙酰辅酶A合成方面存在缺陷，并分析了该突变体在MCDA-葡萄糖、MCDA-丙酮酸或MCDA-乳酸中、存在或不存在不同浓度丙酸时的生长。ackA2（也称为ackA-1；MC58菌株中的NMB435）位于prp基因座。结果表明，ackA2突变体能够在含有5 mM丙酸的MCDA-丙酮酸和含有10 mM丙酸的MCDA-乳酸中生长，而野生型菌株在这些条件下无法生长，这表明丙酸对生长的抑制是由于丙酰辅酶A或其代谢物的积累所致。

令人惊讶的是，我们观察到在含有5 mM丙酸的MCDA-葡萄糖中，ackA2缺陷突变体与野生型菌株之间没有差异，因为两种菌株的生长均受到抑制。这种差异可归因于这样一个事实：脑膜炎奈瑟菌有两个编码真正的乙酸/丙酸激酶的基因，ackA1和ackA2，并且当脑膜炎球菌以葡萄糖为主要碳源培养时，ackA2显著下调。我们假设在这些条件下，丙酰辅酶A的生物合成可能主要由乙酸激酶/丙酸激酶AckA1（也称为ackA-2，MC58菌株中的NMB1518）进行。这一假设得到了逆转录酶实时PCR结果的支持，该结果显示，在MCDA-乳酸或MCDA-丙酮酸中生长至对数生长早期的脑膜炎球菌中，ackA2 mRNA水平显著高于在MCDA-葡萄糖中（分别约高11.9倍和4.3倍）。相比之下，在MCDA-乳酸或MCDA-丙酮酸中生长至对数生长晚期的细菌中，ackA1 mRNA水平显著低于在MCDA-葡萄糖中（分别约低6倍和5.8倍）。逆转录酶实时PCR实验的结果还显示，在MCDA-乳酸或MCDA-丙酮酸中生长至对数生长早期或晚期的细菌中，prpB和prpC mRNA水平显著高于在MCDA-葡萄糖中，证实了当脑膜炎球菌以葡萄糖为主要碳源培养时，MC基因簇显著下调。因此，我们构建了一个ackA1缺陷突变体，结果表明该突变体能在含有5 mM丙酸的MCDA-葡萄糖中生长，证实了我们的假设。我们还注意到，ackA1缺陷突变体能在含有5 mM和10 mM丙酸的MCDA-丙酮酸和MCDA-乳酸中生长。这一发现表明，在MCDA-丙酮酸和MCDA-乳酸中，ackA1和ackA2都参与了丙酸对生长的抑制，而在MCDA-葡萄糖中，只有ackA1参与生长抑制。我们还发现，在无丙酸的MCDA-丙酮酸中，ackA1和ackA2缺陷突变体的生长速度都比野生型菌株快。

关于导致丙酸生长抑制的其他机制，如果2-甲基柠檬酸或2-甲基异柠檬酸的积累是MCDA-葡萄糖中丙酸抑制的主要原因，人们会预期prpB突变体比prpC突变体受到更强烈的抑制。实际上，prpB突变体应积累2-甲基柠檬酸和2-甲基异柠檬酸，如在铜绿假单胞菌中观察到的那样，而prpC突变体则不会。然而，两种突变体在葡萄糖上生长时表现出相同的抑制程度，这使得这些假设在脑膜炎奈瑟菌中不太可能成立。相反，如果TCA循环和糖异生途径中草酰乙酸耗竭主要参与丙酸生长抑制，人们会预期野生型菌株比prpB和prpC突变体受到更强烈的抑制，但情况并非如此，至少当细菌在MCDA-葡萄糖或MCDA-丙酮酸中生长时是如此。改变的硫醇代谢也可以排除为主要机制，因为在野生型以及prpB和prpC突变体在MCDA-葡萄糖或MCDA-乳酸中生长、添加5 mM丙酸并孵育1小时或不添加丙酸后测定的细胞内谷胱甘肽水平显示菌株之间没有显著差异。

我们的数据反而表明，脑膜炎奈瑟菌中丙酸对生长的抑制可能是由丙酰辅酶A的积累介导的，导致丙酮酸脱氢酶抑制和/或由柠檬酸合酶产生有毒的2-甲基柠檬酸异构体，如其他微生物中所示。关于丙酮酸脱氢酶可能受到的抑制，我们发现在MCDA-乳酸、MCDA-葡萄糖和MCDA-丙酮酸中生长至对数期中期的野生型细菌的细胞内丙酮酸水平不同（分别为19.6 μM ± 2.2、16.1 μM ± 0.9和3.9 μM ± 0.2），这可能有助于解释细菌在不同培养基中对丙酸的不同敏感性。

丙酸的摄取不是由乳酸通透酶介导的

有趣的是，我们发现当丙酸浓度为5 mM时，所有三种菌株（野生型菌株以及prpB和prpC突变体）在MCDA-葡萄糖中都无法生长，而它们在MCDA-乳酸中却能生长，问题是：为什么当以乳酸为碳源时，菌株对丙酸不敏感？一种可能的解释是高乳酸浓度可能干扰丙酸的进入。事实上，在脑膜炎球菌中，乳酸通过L-乳酸通透酶LctP（MC58菌株中的NMB0543）进入，该酶属于LldP-乳酸/乙醇酸-质子同向转运蛋白超家族，并且已表明一些乳酸-质子同向转运蛋白对底物的异构形式不敏感，并且通常也能够转运其他短链单羧酸盐，如丙酮酸和丙酸。此外，几种乳酸转运蛋白也作为反向转运蛋白发挥作用，其中底物的输入与产物的输出相关联，如在一些乳酸菌中，在苹果酸乳酸发酵期间，它们以乳酸交换的方式输入苹果酸。

因此，我们构建了一个lctP缺陷突变体，并分析了该突变体在MCDA-葡萄糖或MCDA-丙酮酸中、存在或不存在不同浓度丙酸时的生长。正如预期，该突变体无法在MCDA-乳酸中生长，表明LctP对于将L-乳酸和D-乳酸转运进入细菌是必需的。结果还证明，在不同浓度丙酸存在下，lctP突变体与野生型菌株的生长没有差异，从而得出结论：乳酸摄取不干扰丙酸进入细菌。因此，乳酸与丙酸进入细菌的竞争机制或通过乳酸通透酶将丙酸从细菌中排出的机制不太可能成立。这一结论得到了证据的支持，即野生型菌株在所有分析的培养基（包括MCDA-乳酸）中生长期间，细胞外丙酸浓度下降，表明丙酸在含有葡萄糖、丙酮酸或乳酸的生长过程中被消耗。

一个编码推定的α-酮丁酸转运蛋白的基因位于几种脑膜炎球菌菌株的MCC基因簇中

对128个完全注释的脑膜炎奈瑟菌基因组的分析显示，prpC和acnD之间的区域存在种内变异。在128个完全注释的基因组中，有41个在该区域定位到一个编码功能未知的4-甲苯磺酸盐摄取通透酶（TSUP）家族蛋白的基因（MC58菌株中的NMB0432）。相比之下，在11个基因组中，该区域定位到两个基因：第一个编码一个属于GntB_guanitoxin超家族的推定的脂肪酸去饱和酶；第二个编码一个药物/代谢物（DMT）家族的未知转运蛋白。在75个基因组中，该区域发现一个编码M15家族金属肽酶的基因，其后是一个编码含有DUF819结构域的蛋白的基因。此外，在一个菌株M22425中，我们发现了MCC基因簇中的基因组重排，可能是由IS5样元件转座到prpC下游所促进的。

我们专注于编码TSUP家族蛋白的基因。TSUP（也称为TauE/SafE/YfcA/DUF81家族）是一个庞大的蛋白质家族，只有少数特征成员被认为催化各种有机硫化合物的转运。尽管基因组背景分析最初支持许多TSUP同源物基于硫的化合物转运的推定作用，但TSUP家族固有的序列多样性以及进一步的基因组分析表明，该家族的成员可能参与范围广泛的化合物的转运，包括几种氨基酸和有机酸，如甘氨酸和乙酸，如Shewanella oneidensis所示。此外，一个与脑膜炎奈瑟菌编码TSUP家族蛋白的基因高度同源的基因（属于同一簇，命名为Pas1）在Photorhabdus asymbiotica中被发现与MCC基因簇相关联。这表明TSUP家族蛋白与MCC之间存在功能联系。

因此，我们构建了一个突变体，其中编码TSUP家族蛋白的基因（此处称为kbuT）被插入失活，从野生型MC58菌株开始，并分析了该突变体和野生型菌株在MCDA-葡萄糖或MCDA-乳酸中、存在或不存在不同浓度丙酸时的生长。然而，在野生型菌株和kbuT缺陷突变体之间没有观察到差异。因此，考虑到在kbuT突变体中失活的基因编码一个推定的转运蛋白，使用BIOLOG表型微阵列系统来搜索突变体菌株在氧化特定底物方面可能存在的缺陷。与文献发现一致，野生型MC58菌株对以下底物测试呈阳性：α-D-葡萄糖、D-麦芽糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-乳酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、α-羟基丁酸、α-酮丁酸和乙酸。值得注意的是，kbuT缺陷突变体对所有