克氏锥虫TcI型株在体外感染中诱导滋养层细胞隔离与RNA剪接阻滞的双转录组学分析

《Microbiology Spectrum》：Dual transcriptomics suggests trophoblastic sequestration and splicing blockade induced by Trypanosoma cruzi during in vitro infection

本研究采用双转录组学技术，首次系统揭示了克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）离散分型单元I（DTU TcI）在体外感染人滋养层细胞（BeWo）过程中的分子互作机制。研究发现，高感染力的MG株通过调控其表面多基因家族（如转唾液酸酶）的表达，并诱导宿主细胞发生显著的转录组重塑，包括组蛋白上调和RNA剪接相关基因下调，提示染色质重构和RNA加工过程受阻。尤为重要的是，研究在感染后期（120小时）发现了坏死性凋亡（necroptosis）通路的激活，这为理解TcI株在先天性恰加斯病（Chagas disease）中相对较低的传播率提供了新的分子视角。该研究为阐明锥虫穿越胎盘屏障的机制及开发针对先天性感染的干预策略提供了宝贵的转录组资源。

　　

评估滋养层细胞感染

研究首先对两种克氏锥虫TcI株（MG和DA）的感染能力进行了生物学表征。结果显示，两种虫株均能侵入并在滋养层细胞内复制。MG株在感染72小时后达到峰值，每个细胞内可见多达36个无鞭毛体（amastigotes），并实现100%的细胞感染率。相比之下，DA株的感染峰值出现在96小时，每个细胞约20个无鞭毛体。在细胞衍生的锥鞭毛体（cell-derived trypomastigotes, CDTs）产量上，MG株（246,666 CDTs/mL）也高于DA株（180,000 CDTs/mL）。这些数据表明，即便在同一DTU内部，不同虫株间也存在显著的感染性差异，MG株展现出更强的侵袭和复制能力。因此，后续的转录组分析聚焦于感染性更强的MG株。

BeWo细胞的转录景观评估

通过比较感染细胞与未感染细胞在72小时和120小时两个时间点的基因表达，研究发现宿主细胞发生了深刻的转录组重塑。主成分分析（PCA）显示感染组与对照组明显分离。

在72小时，共发现2,607个差异表达基因，其中1,357个上调，1,145个下调。到120小时，差异表达基因数量为1,310个，以上调为主（815个上调 vs 495个下调）。对表达变化最显著的50个基因进行功能注释发现，组蛋白（histones）、G蛋白偶联受体和核核糖核蛋白相关基因显著上调，而与妊娠相关分子、细胞外基质成分、DNA结合蛋白、电子传递链和剪接体复合物相关的基因则被下调。

基因本体论（GO）分析进一步证实了上述发现，并揭示了免疫反应、活性氧（ROS）产生、DNA损伤应答与修复、转录调控等通路的激活。同时，TORC1通路、MAPK级联反应、细胞应激反应、细胞周期调控和翻译过程也呈现上调。相反，剪接体复合物则持续下调。

对72小时上调基因的相互作用网络分析揭示了不同的功能簇，包括与DNA修复、染色质结构相关的基因簇（包含H1、H2A、H2B、H3、H4等组蛋白变体）；与细胞骨架组织、信号转导和粘附相关的基因簇（如ACTA2, VIM）；与类固醇生成通路相关的基因簇（如CYP19A1）；以及免疫相关基因簇（如KLRD1, CCL28）。

在120小时，细胞凋亡过程，特别是坏死性凋亡被激活。关键基因H2AX（参与DNA修复）和TRPM7（参与离子稳态和细胞信号传导）的上调，表明宿主细胞在感染后期可能通过这种程序性细胞死亡形式来应对感染。

克氏锥虫I型在感染滋养层细胞时改变其基因表达谱

对寄生虫本身的转录组分析比较了72小时（细胞内无鞭毛体峰值）和120小时（锥鞭毛体产生峰值）的基因表达。PCA分析显示两个时间点的表达谱截然不同。差异表达分析共鉴定出157个克氏锥虫基因，其中28个在120小时显著上调，129个显著下调。

对上下调最显著的25个基因（共50个）进行功能注释发现，13个基因属于多基因家族，包括转唾液酸酶和黏蛋白（mucins），但其表达模式各异。上调基因包括编码β-微管蛋白（β-tubulin）、糖基转移酶（glycosyltransferases）和核糖体蛋白的基因。GO分析也表明，与细胞骨架组织和功能相关的基因显著上调。

而下调基因则显著富集在RHS反转录转座子（retrotransposons）、RNA聚合酶II活性和糖酵解酶相关基因，提示转录机器和代谢通路可能受到抑制。

GO和KAAS通路富集分析表明，与核苷、核苷酸和碳水化合物等能量前体代谢相关的通路被上调，而与蛋白质、氨基酸和磷酸化化合物代谢相关的通路则被下调。KAAS分析特别指出核糖体通路相关基因（如编码L5e和L27A核糖体蛋白的基因）表达上调。

对全部差异表达基因的注释再次强调了多基因家族成员的作用，尤其是下调的转唾液酸酶基因（包括Group II的4个基因和Group VIII的1个基因），表明这些表面蛋白的表达可能随寄生虫生命周期阶段（从无鞭毛体到锥鞭毛体）的转换而发生动态变化。

讨论与结论

先天性克氏锥虫感染是一个全球性的健康问题。虽然以往研究多关注TcII、TcV和TcVI等DTU，但本研究强调TcI同样具备先天性传播的能力。MG和DA株在体外感染中表现出的差异，凸显了虫株间遗传和表型变异的重要性，这种变异可能影响其致病性和传播潜力。

对MG株感染的双转录组学分析揭示了寄生虫在从无鞭毛体向锥鞭毛体分化过程中剧烈的转录组重塑。转唾液酸酶等表面蛋白表达的变化，以及核糖体蛋白和糖基转移酶基因的上调，反映了寄生虫为适应细胞内环境、完成生命周期而进行的精细调控。代谢通路的转变（如上调核苷酸代谢，下调氨基酸代谢）也符合锥虫在营养压力下的适应策略。

在宿主方面，滋养层细胞的转录组变化表明，克氏锥虫通过多种机制操纵宿主细胞。组蛋白和核糖核蛋白的上调可能意味着染色质结构和RNA代谢的改变，而剪接相关基因的下调则可能破坏宿主正常的基因表达程序，有利于寄生虫的免疫逃逸和持续感染。尤为新颖的发现是感染后期坏死性凋亡通路的激活，这可能是一种不同于传统凋亡的宿主反应机制，其过度的炎症反应可能反而损害胎盘屏障的完整性，这或许部分解释了TcI株先天性传播率相对较低的现象。

本研究首次对TcI株与人类滋养层细胞的相互作用进行了系统的双转录组学分析，揭示了双方复杂的分子对话。研究结果不仅增进了对先天性恰加斯病发病机制的理解，也为发现新的诊断标志物和治疗靶点提供了重要线索。未来研究需要进一步探索细胞骨架介导的信号通路、RHS元件在驱动表型变异中的作用，以及坏死性凋亡在先天性感染中的确切角色。