肠道来源胞内分枝杆菌的基因组进化与功能适应性：从炎症性肠病患者中分离菌株的深入解析

《Microbiology Spectrum》：Genomic insights and functional adaptation of Mycobacterium intracellulare strains isolated from patients with inflammatory bowel disease

本研究首次报道了从炎症性肠病（IBD）患者肠道样本中分离的4株胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare）的全基因组测序（WGS）结果，通过比较基因组学揭示了其独特的基因组简化（Reductive Evolution）现象、代谢功能适应性改变及潜在的毒力进化特征。研究指出，与参考菌株ATCC 13950T相比，肠道分离株存在约110 kb的基因组差异区域（ROD），且表现出较高的突变分化和较低的同源重组率，提示其进化以克隆性扩张为主。这些发现为理解胞内分枝杆菌在肠道环境中的定植机制、宿主适应性及其临床诊疗策略的优化提供了重要的基因组学依据。

　　

ABSTRACT

在临床实践中，将炎症性肠病（IBD）错误归因于副结核分枝杆菌（MAP）并导致误治一直是医疗工作者面临的挑战。这凸显了准确识别和表征胃肠道（GI）溃疡患者中MAP成员的必要性。研究人员对889名表现出IBD症状的患者进行了MAP感染检测。虽然未从任何样本中分离出MAP，但成功从诊断为IBD患者的胃肠道样本中分离并测序了四个临床相关的胞内分枝杆菌基因组。深入的系统发育基因组学和比较基因组学分析表明，胞内分枝杆菌物种存在基因组异质性和可变的代谢特征。对四个分离株基因组的分析揭示了一个持续的基因组简化过程，这可能对肠道胞内分枝杆菌菌株的适应性和毒力增强至关重要。研究结果为了解胞内分枝杆菌菌株的窄谱抗生素耐药性、代谢适应性和潜在毒力提供了见解，特别是那些与人类感染相关的菌株。重组分析显示重组事件极少而突变分化较高，这表明进化约束导致了胞内分枝杆菌物种的克隆进化。

INTRODUCTION

分枝杆菌病有着悠久的历史，在全球发达和发展中地区持续构成重大的健康挑战。下一代测序（NGS）和比较基因组学方法促进了分枝杆菌成员的稳健和独特分类。比较基因组学工具与复杂的生物信息学算法相结合，促进了对基因组和进化特征的深入探索，为鸟分枝杆菌复合群（MAC）成员的高分辨率准确鉴定提供了支持。鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌是关键的MAC成员，普遍存在于土壤、牲畜种群和水生生态系统中。它们能够在细胞内生存的特性使其成为影响身体器官和胃肠道（GI）道的合适候选者。胞内分枝杆菌涉及播散性和局部性GI感染，对免疫系统受损的个体构成更高风险。早期的基因组研究报道了多种临床重要的胞内分枝杆菌菌株，主要从患有肺部疾病的患者中分离得到。Jia等人最近的一项研究结合比较基因组学和机器学习技术，确定了区分各种致病性非结核分枝杆菌的关键特异性诊断标志物，特别强调了胞内分枝杆菌物种。此外，Hirama等人显示了胞内分枝杆菌的重要性，强调了其临床相关性和从免疫功能低下患者中频繁分离的情况。探索遗传多样性和进化趋势可以为胞内分枝杆菌物种群的适应机制和致病潜力提供有价值的见解。胞内分枝杆菌及其亚种嵌合分枝杆菌与人类感染相关，前者涉及肺部感染，而后者最终与心脏手术后的致命感染相关联。两个胞内分枝杆菌亚种，包括永戈分枝杆菌亚种和嵌合分枝杆菌亚种，分别从永戈分枝杆菌和嵌合分枝杆菌重新分类而来。近年来，胞内分枝杆菌感染发生率的显著增加引起了极大的关注和关注。因此，正确识别和及时治疗对于管理和控制免疫功能低下患者中胞内分枝杆菌感染风险至关重要。迄今为止，已有大量胞内分枝杆菌全基因组报告可用，它们主要从患有肺MAC疾病患者的肺组织中分离得到。肠道胞内分枝杆菌的研究非常不足；报告肠道定居鸟胞内分枝杆菌的病例研究非常罕见。根据目前的知识，从人类GI道分离的胞内分枝杆菌的完整基因组序列尚未见报道。这是首份关于从人肠道分离的肠道胞内分枝杆菌菌株的全基因组测序（WGS）报告。本研究进行了全面的系统发育基因组学和比较基因组学分析，以确定四种肠道胞内分枝杆菌分离株的独特基因组特征。本研究通过与其他公开可用的非肠道胞内分枝杆菌基因组的比较，观察到了胞内分枝杆菌分离株中独特的基因组特征。该研究强调了还原性进化过程和功能必需基因的丢失在肠道胞内分枝杆菌菌株适应中的潜在作用。重组、耐药性和毒力基因分析揭示了胞内分枝杆菌物种成员内部的大规模基因组异质性。理解这些信息对于制定先进的治疗和管理策略以减轻胞内分枝杆菌感染风险至关重要。

MATERIALS AND METHODS

对889名炎症性肠病（IBD）患者的结肠活检和血液血沉棕黄层样本进行了分枝杆菌病原体（包括高度特异性针对MAP的IS900序列）的培养和DNA检测；患者类型包括克罗恩病（CD）（根据ECCO共识指南的临床表现、内镜、放射学和组织学特征）、肠结核（临床、放射学、内镜、组织病理学特征）、溃疡性结肠炎（根据ECCO共识指南）和对照组（患有痔疮出血且无其他结肠疾病接受乙状结肠镜检查的成年患者）。

临床观察

描述了四名患者的临床特征：IBD 3019（分离株A1，溃疡性结肠炎）、ITB 2346（分离株B1，肠结核）、IBD3273（分离株C1，溃疡性结肠炎）和ITB 2409（分离株S24，肠结核）。

微生物培养

实验室对患者的临床表现和支持性发现不知情。处理后的样本同时进行抗酸染色涂片、液体培养和GeneXpert MTB/RIF（以排除结核病）。结肠活检和血液血沉棕黄层样本进行标准的N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠（NALC-NaOH）去污染和离心浓缩。每个样本的浓缩沉淀物接种到两个MGIT管（补充有OADC、PANTA和2 μg分枝杆菌素J）中以排除结核分枝杆菌/牛分枝杆菌，并在37°C培养。对于MAP，培养物孵育1年，每月进行一次IS900 PCR检测。当MGIT管呈阳性读数时，将0.1 mL管内容物接种到血琼脂/Mueller Hinton琼脂上，并通过光学显微镜检查革兰氏染色和抗酸染色的涂片。除副结核分枝杆菌外的分枝杆菌分离株通过标准方法进行鉴定。

WGS、组装和注释：基因组DNA提取和WGS

分枝杆菌分离株在Lowenstein-Jensen培养基中培养，并在37°C孵育。细菌培养物悬浮于0.1 mL PBS中，并在95°C热灭活40分钟。将热灭活样品转移到BSL2实验室，加入40 μL溶菌酶，并在37°C摇动水浴中孵育2小时。孵育后，加入56 μL 10% SDS和5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），涡旋混合，并在65°C孵育30分钟。然后加入80 μL 5 M NaCl；64 μL CTAB-NaCl，涡旋混合，并在65°C再孵育30分钟。通过标准氯仿-异戊醇DNA提取程序纯化基因组DNA。纯化的DNA使用Qubit 4荧光计（Thermo Scientific）和琼脂糖凝胶电泳进行分析。使用Illumina DNA Prep工作流程和Nextera DNA Flex文库制备试剂盒按照制造商的说明（Illumina Inc., USA）制备文库。简而言之，DNA进行标签化、标签化后清理、标签化DNA的扩增和文库清理。然后使用Qubit 4荧光计（Thermo Fisher Scientific）和Fragment Analyzer（Agilent Technologies, Inc., USA）分析文库。然后使用重悬缓冲液将文库标准化并汇集至最终起始浓度为4 nM。将汇集的4 nM文库使用新鲜制备的0.2 N NaOH进行变性。将变性文库稀释至最终上样浓度为12 pM。总体积600 μL使用MiSeq试剂盒v3（600 cycles）加载到MiSeq仪器上。

组装和注释

使用FastQC v0.11.5评估Illumina reads的质量和污染。为确保遗传数据的准确性，使用默认设置的Trimmomatic v0.36去除低质量reads和接头序列。使用默认模式的Unicycler v.0.4.7对修剪后的reads进行从头组装，然后使用QUAST 4.6.1评估组装基因组的质量。使用NCBI原核基因组注释流程（PGAP版本4.9）以默认参数对组装的基因组进行注释。为确保准确性，使用CheckM2工具评估基因组的完整性和污染。使用GTDB-tk V2程序在物种水平上对组装的基因组进行 taxonomic 分配。

比较基因组学

使用ncbi-genome-download程序从NCBI基因库检索胞内分枝杆菌菌株的基因组序列，并使用CheckM2工具评估其质量。为了确定物种界限，获得了整体基因组相关性指数（OGRIs），特别是ANIb、AAI和计算机DDH（insDDH）值，并估计了四个分离株与参考胞内分枝杆菌ATCC 13950^T菌株的基因组相关性。为了构建核心基因组树，基于胞内分枝杆菌基因组之间的BlastP搜索（e值=1.0 e^?15；比对覆盖率≥70%）选择基因。使用PhiPack程序中实施的PhiTest功能从下游分析中去除重组基因。将确定的、统计上非重组的核心基因连接、比对，并使用RAxML工具采用广义时间可逆模型构建最大似然系统发育树。使用ABRicate软件，通过针对两个数据库——VFDB 2022和MEGARes 2.0——进行blast搜索来鉴定毒力基因，阈值覆盖率和同一性为90%。为了研究抗菌素耐药基因，对胞内分枝杆菌菌株的基因组进行了blast筛选，使用两个数据库：综合抗菌素耐药性数据库（CARD）和RESfinder。通过RPS BLAST搜索COG数据库对编码序列进行直系同源簇（COG）功能注释。使用Manhattan距离和R程序中gplots包的热图2函数嵌入的平均聚类方法生成热图，以说明基于各种COG类别基因分布的基因组聚类。比较了重组参数并计算了胞内分枝杆菌基因组之间的相关性谱。使用mcorr工具测量核心基因组中任何两个被一定数量核苷酸分隔的位点之间的相关程度。这允许计算五个重组参数：样本多样性、重组覆盖率、突变分歧、重组分歧和重组与突变的相对速率。在后续分析中，还鉴定了基本的和非必需的关键基因组区域。DELEAT自信地采用逻辑回归分类器，该分类器已在必需基因数据库（DEG）中高度选择性生物子集上进行了训练。该分类器为基因组中的每个基因分配一个必需性得分，必需性阈值为0.75，从而能够精确识别必需和非必需区域。该得分范围从0到1，基于多个基因特征，代表基因属于“必需”类别的概率。该工具还擅长设计跨细菌基因组的大规模可缺失区域，由两个参数指导：最小期望缺失长度（L）和必需性得分（E）。生成一个摘要，包括诸如缺失大小、缺失计数以及本研究中测序的四个胞内分枝杆菌基因组内缺失顺序等因素。使用默认设置的Roary版本3.11.2分析gff格式的胞内分枝杆菌基因组，并使用create_pan_genome_plots.R生成泛基因组图。此外，使用PIRATE（v.1.0.3）泛基因组学工具鉴定存在于至少一个基因组中的独特等位基因并聚类存在于不同基因组中的直系同源基因，这有助于区分密切相关的胞内分枝杆菌菌株。本研究在参考胞内分枝杆菌基因组和肠道胞内分枝杆菌分离株之间进行了全基因组比对，并通过使用CGView Comparison Tool中的BLASTP搜索进行成对比较来可视化，以鉴定差异区域（ROD）。

RESULTS

胞内分枝杆菌物种的一般基因组特征

对四个胞内分枝杆菌分离株（A1、B1、C1和S24）基因组进行了测序，并使用NCBI PGAP流程进行了注释。一般基因组特征和OGRI值列于表1。使用getSequenceInfo工具从NCBI数据库获得了总共82个胞内分枝杆菌基因组。根据分离来源、基因组大小和GC含量对基因组进行排序，GC含量范围分别为5.2至6.6 Mbp和67.2%至68.6%。ANI和AAI值均高于已建立的95-96%阈值，表明分离株属于胞内分枝杆菌物种。此外，计算机基因组DNA-DNA杂交（insDDH）值超过了70%的截止标准，进一步验证了测序基因组作为胞内分枝杆菌的物种划分。总之，ANI、AAI和insDDH数据共同支持将所有四个分离株基因组分类为胞内分枝杆菌物种。

胞内分枝杆菌菌株的核心基因组系统发育和功能分析

核心基因组系统发育重建经常用于进化分析、宿主特异性和爆发监测，涉及各种病原体，如结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌和李斯特菌。基因对基因的比较方法识别核心基因并利用它们推断给定物种成员之间的进化关系。为了研究胞内分枝杆菌菌株之间的系统发育基因组关系，我们使用存在于所有胞内分枝杆菌基因组（86个基因组）中的非重组核心基因（1,824个基因）构建了一个最大似然系统发育树。仔细研究核心基因树可以推断胞内分枝杆菌菌株的进化与其分离来源关系较弱，因为它们不顾其起源和宿主来源而不同地聚类。尽管少数系统发育分支与美国和日本的分离株不同，但这主要是由于从当地区域分离的克隆菌株。S-24菌株显示出较远的系统发育关系，而A1、B1和C1聚集在一个单一分支中，共享一个最近的共同祖先，这可能是由于S-24菌株的高遗传多样性。此外，系统发育位置表明S-24的近亲主要是胞内分枝杆菌的亚种，这支持了S-24分离株可能属于胞内分枝杆菌亚种组的观点。这些成员表现出复杂的进化信号和高遗传异质性，导致系统发育树中频繁出现亚分支（多个后代谱系）。

本研究还调查了基因组编码的代谢功能，以提供每个胞内分枝杆菌菌株独特功能谱的宝贵见解。基于COG功能类别的胞内分枝杆菌基因组的层次聚类显示了代谢功能相对富集的高度变异性。COG功能热图显示了基于代谢谱的胞内分枝杆菌菌株的清晰分组。我们观察到五个具有不同代谢谱的 distinct 簇。然而，分离株C1和S-24（来自本研究）表现出高度降低的代谢能力，很少有基因被分配到任何代谢功能。在C1菌株中观察到的这种降低的代谢功能可能归因于较差的测序或组装质量，如低完整性和高污染水平所示。簇1和簇5相对于其他胞内分枝杆菌菌株表现出降低的代谢潜力。

基因组比对鉴定四个胞内分枝杆菌分离株中的ROD

Kim等人首次报道了胞内分枝杆菌物种的参考基因组（胞内分枝杆菌菌株ATCC 13950^T）。我们将四个肠道胞内分枝杆菌分离株基因组与参考胞内分枝杆菌菌株ATCC 13950^T进行了比对。在所有四个肠道分离株中鉴定出大约110 kbp长的ROD。仔细检查ROD发现，与参考胞内分枝杆菌菌株相比，分离株基因组中缺失了156个蛋白质编码基因。这些缺失的遗传区域包含对多种功能至关重要的基因，例如转运蛋白活性、转录调控和细胞代谢。

胞内分枝杆菌菌株的耐药性、毒力和泛基因组

我们观察到四个抗生素耐药基因（rpob2、RbpA、efpA和mtrA）持续存在于胞内分枝杆菌基因组中。四个分离株基因组中有三个显示出rpob2、RbpA、efpA和mtrA耐药性，而C1分离株缺乏rpob2和RbpA基因，这可能是由于其基因组大小减小和CDS相对较少，如表1所述。菌株C1中未鉴定出rpob2很可能归因于该菌株观察到的较低组装质量指标，如CheckM工具评估的较低完整性和较高污染水平所示。这些抗生素耐药基因主要赋予对利福平、异烟肼和大环内酯类抗生素的耐药性。有趣的是，胞内分枝杆菌菌株编码多个普遍存在的毒力因子基因。共鉴定出20个毒力因子基因，esxM（ESX-5型VII分泌系统EsxA，ESAT-6）和esxN（ESX-5型VII分泌系统EsxA，ESAT-6）是胞内分枝杆菌物种内最常出现的毒力因子基因。各种毒力因子基因的存在/缺失谱以彩色热图描绘。此外，本研究评估了不同胞内分枝杆菌菌株中泛基因和核心基因含量的 variation。泛基因和核心基因分析数据拟合到指数模型以绘制核心和泛基因组大小。

一项全面的泛基因组分析，结合了四个胞内分枝杆菌菌株以及来自NCBI数据库的另外82个菌株，鉴定出1,855个核心基因、1,872个软核心基因、2,922个外壳基因和17,383个云基因。核心基因高度保守并提供系统发育信息，而外壳基因和云基因更灵活并在基因组之间变化，展示了增强的基因组适应性和多样性。核心基因组仅占整个泛基因组的7.71%，其余92.29%为辅助基因。随着额外胞内分枝杆菌基因组的采样，预计外壳基因和云基因的数量会增加。某些胞内分枝杆菌菌株在泛基因组系统发育树上被观察到聚集成一个独特的组，其特征是辅助基因相对丰富。这一发现与先前在55个胞内分枝杆菌基因组的泛基因组分析中观察到的高比例柔性基因组相吻合。

必需基因和重组分析

基因必需性分析预测了胞内分枝杆菌分离株A1、B1、C1和S24中分别有1,426、1,512、1,300和1,141个必需基因。随后，必需基因的功能分析揭示了某些COG功能（能量产生和转换、翻译核糖体结构和生物发生、氨基酸转运和代谢以及一般功能）的一致丰度，这些对肠道胞内分枝杆菌分离株似乎是必需的。这些COG代谢功能对于维持肠道胞内分枝杆菌菌株的细胞过程可能至关重要。在过去十年中，在理解由密切共生关系驱动的“基因组减少综合征”现象方面取得了重大进展。为了研究基因组减少，我们探究了潜在的缺失倾向基因组区域。胞内分枝杆菌S-24拥有27个缺失倾向片段，是所有肠道胞内分枝杆菌分离株中最高的，占其整个基因组的17.3%，其次是胞内分枝杆菌A1（9个片段）、胞内分枝杆菌B1（8个片段）和胞内分枝杆菌C1（2个片段）。此外，我们采用mcorr方法研究胞内分枝杆菌菌株内的同源重组率，该方法通过比较成对基因组创建相关性谱，以评估一个位点存在差异时给定另一个位点存在差异的概率。从我们的分析中，我们观察到作为位点距离（l）函数的平坦相关性谱，表明胞内分枝杆菌菌株中的重组信号较弱。从胞内分枝杆菌菌株的重组分析中获得了多个重组参数，包括样本多样性（d）、突变分歧（θ）、重组分歧（φ）、重组与突变的相对速率（γ/μ）和重组覆盖率（c）。胞内分枝杆菌物种的d值或样本多样性估计为0.10，源自导致克隆进化的重组和突变。这表明与其他致病细菌物种（肺炎克雷伯菌、脓肿分枝杆菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和鼠疫耶尔森菌）相比，胞内分枝杆菌表现出更大的样本多样性。在胞内分枝杆菌菌株中，其余四个重组参数θ、φ、γ/μ和C的值分别为0.11、0.01、7.2和0.7。突变分歧（θ），定义为自一对同源位点分化以来每个位点突变数的平均值，发现胞内分枝杆菌的值高于其他致病物种，如铜绿假单胞菌、脓肿分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、肠沙门菌和假中间葡萄球菌。对于胞内分枝杆菌染色，重组分歧（φ）和重组覆盖率（c）表现出较低的值0.01和0.7，与其他致病细菌物种相比。类似地，重组与突变的相对速率（γ/μ）显示出较低的值0.7%，与肠沙门菌亚种和铜绿假单胞菌相比。

DISCUSSION

多位点序列分析已广泛用于系统发育基因组学研究，以辨别受环境因素和选择压力影响的MAC成员之间的进化特征。在本研究中，核心基因组系统发育树表明胞内分枝杆菌菌株的进化独立于其分离来源，因为它们不顾其起源和宿主来源而不同地聚类。功能热图清楚地将胞内分枝杆菌基因组分为五个主要组，每个组展示出独特的功能谱。很明显，美国（WUMAC）分离株包括分离株S-24（肠道分离株）构成簇1，表现出降低的功能能力。仔细分析功能热图，很明显胞内分枝杆菌菌株的功能能力稳步下降。簇1显示出最低的代谢能力，其次是簇5、簇3、簇4和簇2。值得注意的是，簇1胞内分枝杆菌WUMAC菌株从患有肺MAC感染的患者中获得，这表明宿主适应可能导致WUMAC菌株的代谢功能下降。这一观察结果强调了理解和解决MAC分离株代谢能力的重要性，以深入了解分枝杆菌物种的宿主适应。总体而言，胞内分枝杆菌物种可能正在经历基因组精简（基因组减少）过程，可能使其更依赖于宿主机制。这很重要，因为除了ROD之外，它提供了进一步证据支持本研究中分析的胞内分枝杆菌分离株中存在缺失倾向（可缺失）基因组区域。研究报告了分枝杆菌基因组中的缺失，表明这些缺失可能对生物体有轻度有害，但它们可能通过帮助逃避宿主免疫系统从而促进传播而赋予优势。在肠道胞内分枝杆菌分离株中，可缺失遗传区域不涉及专门与致病性或抗生素耐药性相关的基因；它 collectively 与细菌体内存活所必需的能量代谢相关。这提供了关于胞内分枝杆菌基因组如何进化的见解，通过减少代谢基因同时保留在宿主环境中生存所必需的基因，变得越来越依赖于宿主机制。水平基因转移事件对塑造MAC物种的毒力特性、免疫逃避和适应性做出了重大贡献。比较基因组学显示MAC成员可能具有开放的泛基因组，这与我们的发现一致，证明了胞内分枝杆菌菌株的开放泛基因组。我们调查了胞内分枝杆菌泛基因组中的直系同源基因家族，发现亚支2.1的成员表现出扩展的泛基因组基因家族。这表明胞内分枝杆菌菌株，特别是来自亚支2.1的菌株，可能正在经历基因内容的显著变异并表现出增加的遗传冗余。外源遗传元件的获取以及移动遗传元件相对于非必需遗传信息的优先保留可能显著促进该支内菌株的生存和进化适应性。

抗生素耐药基因分析显示，胞内分枝杆菌菌株不表现出广谱抗生素耐药性，与Fernández等人的发现一致。此外，利福平和异烟肼耐药性的过度表达与Mizuguchi等人报道的结果一致。与抗生素耐药基因不同，胞内分枝杆菌物种拥有更多的毒力基因，支持了人类相关胞内分枝杆菌菌株的潜在毒力。esxN和esxM毒力基因的过度表达表明胞内分枝杆菌菌株中存在活跃的ESX-5系统。这可能潜在地解释在胞内分枝杆菌物种中观察到的细胞壁完整性降低和毒力特性增强。

必需基因的研究在合成生物学、药物发现和疫苗开发等多个领域具有重要意义。必需的细菌蛋白由于其细菌生命中的关键作用已成为新抗生素的潜在药物靶点。迄今为止，只有Tateishi等人进行的一项研究使用转座子测序研究了胞内分枝杆菌必需基因。Tateishi等人鉴定了几种与抗结核药物靶点、毒力因子和碳代谢相关的基因对胞内分枝杆菌物种的生存和功能至关重要。我们的分析表明，信息存储和处理以及代谢是最必需的，其次是能量产生和转换、翻译和核糖体结构生物发生以及氨基酸转运和代谢。这一结果与早期的发现一致，表明细菌物种中的必需基因主要涉及与代谢、信息存储和处理相关的功能。然而，应该指出的是，相当一部分（28-54%）的必需基因特征不佳或缺乏COG注释。这可能是由于存在大量已变得必需的“保守假设”蛋白质，从而扩大了胞内分枝杆菌物种组中必需假设蛋白质的库。实验研究表明，细菌基因组表现出对缺失事件的偏好超过扩展事件，并且显著的缺失可以在短进化时间框架内发生。对胞内分枝杆菌分离株基因组进行了分析以预测缺失倾向或可缺失基因组区域。S24菌株表现出最高数量的缺失倾向基因组区域，约占其总基因组区域的17.3%，其次是A1（5.6%）、B1（4.6%）和C1（1.2%）。含有可缺失基因组区域的肠道胞内分枝杆菌菌株突显了正在进行的基因组减少事件，这些事件驱动了降低的基因组复杂性、改善的基因组稳定性和优化的细胞功能能量成本。有趣的是，这与在四个分离株中鉴定出的ROD一致，这些ROD与参考胞内分枝杆菌菌株相比是缺失的。这些发现揭示了胞内分枝杆菌菌株的多样化基因组特征及其对各种环境中生存和适应的潜在影响。

通常认为水平基因转移和重组在NTM物种中很少见；这些现象被认为主要发生在它们的祖先成员中，在结核分枝杆菌复合群（MTBC）菌株进化过程的早期阶段。近年来，几项关于MTBC成员的基因组研究，重点关注牛分枝杆菌，强调了MTBC菌株中重组的情况。然而，有限的核苷酸序列变异通常使得难以检测这些事件。在本研究中，所有公开可用的胞内分枝杆菌基因组（n = 86）以及肠道分离株基因组（n