基于RHAM技术的Pluslife快速SARS-CoV-2检测试剂盒性能评估：与EasyNAT核酸快检及Wondfo抗原检测的比较研究

《Microbiology Spectrum》：Evaluation of the RHAM-based Pluslife Rapid SARS-CoV-2 assay and comparison with EasyNAT Rapid SARS-CoV-2 assay and Wondfo 2019-nCoV antigen assay

本文评估了基于RNase Hybridization-Assisted amplification (RHAM) 等温扩增技术的Pluslife快速SARS-CoV-2检测试剂盒的性能。研究显示，该试剂盒检测限(LOD)低至400 copies/mL，与RT-qPCR相比，阳性符合率(PPA)和阴性符合率(NPA)分别高达96.30%和99.30% (κ=0.962, P<0.001)，其诊断准确性与EasyNAT试剂盒(PPA 96.30%, NPA 98.60%)相当，并显著优于Wondfo抗原检测(PPA 81.48%)。Pluslife Mini Dock平台凭借其便携性、快速性(7-35分钟)和低成本，为即时检测(POCT)提供了优异解决方案。

　　

ABSTRACT

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 仍然是重大的公共卫生挑战。本研究评估了采用专利性RNase Hybridization-Assisted amplification (RHAM) 等温扩增技术的Pluslife SARS-CoV-2检测试剂盒，并与EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒和Wondfo 2019-nCoV抗原检测试剂盒进行了性能比较。分析性能测试确定Pluslife试剂盒的检测限(LOD)为400 copies/mL，对常见呼吸道病毒无交叉反应，且不受测试物质的干扰。以RT-qPCR作为参考标准，对197份鼻咽拭子样本进行检测，Pluslife试剂盒的阳性符合率(PPA)为96.30%，阴性符合率(NPA)为99.30% (κ=0.962, P<0.001)。EasyNAT试剂盒的PPA为96.30%，NPA为98.60% (κ=0.949, P<0.001)。Wondfo抗原试剂盒的PPA为81.48%，NPA为100% (κ=0.865, P<0.001)。Pluslife试剂盒在SARS-CoV-2检测方面表现出与EasyNAT相当的诊断准确性，同时在便携性、速度和成本方面具有优势。其性能显著超过Wondfo抗原检测，特别是在减少假阴性方面。Pluslife Mini Dock平台在不同场景下进行快速SARS-CoV-2筛查方面显示出潜力。

IMPORTANCE

新开发的Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒是新一代分子即时检测(POCT)方法，基于Pluslife Biotech自主研发的RNase Hybridization-Assisted amplification (RHAM) 等温扩增分子检测技术。本研究的目的是评估这种新型SARS-CoV-2 POCT方法的分析性能和临床性能，并将其临床性能与EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒和Wondfo 2019-nCoV抗原检测试剂盒进行比较。本研究的结果对临床实践具有重要意义。

INTRODUCTION

由SARS-CoV-2引起的急性呼吸道感染仍然构成严峻的公共卫生挑战。灵敏且快速的检测对于切断SARS-CoV-2的传播链至关重要。检测上呼吸道样本中SARS-CoV-2 RNA的实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法因其高灵敏度、高特异性和高稳定性而被广泛认为是临床诊断的金标准。然而，RT-qPCR需要样本运输、核酸提取和纯化，并且依赖于具有精确温控的变温循环仪器进行变性、退火等过程，因此由于其耗时性而不适用于POCT。

为了实现SARS-CoV-2的快速现场筛查，出现了多种基于核酸等温扩增的技术，包括环介导等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、滚环扩增和重组酶聚合酶扩增(RPA)。这些等温扩增技术不涉及变性、退火等步骤，操作快速简便，是临床POCT实施的理想选择。此外，基于等温扩增技术结合其他技术的SARS-CoV-2检测POCT产品也已出现。Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒是新一代分子POCT产品，采用Pluslife的专利RHAM技术。该试剂盒整合了LAMP和RNase HII报告信号可视化技术，与传统POCT产品相比具有低成本和快速出结果等优势。

EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒是Ustar Biotechnologies新开发的CPA试剂盒，设计用于与Ustar的核酸扩增检测分析仪配合使用。该试剂盒将RNA提取、纯化和靶基因扩增集成在一个卡盒内，表现出高灵敏度和特异性，并已验证可用于SARS-CoV-2的临床快速筛查。但Ustar的核酸扩增检测分析仪体积庞大且不便携，限制了其在资源有限或基层环境中的适用性。Wondfo 2019-nCoV抗原检测试剂盒基于胶体金免疫层析法，用于定性检测鼻咽拭子中的2019-nCoV抗原。该试剂盒操作简单快速，适用于家庭自测和大规模现场筛查。然而，由于它仅检测病毒的表面蛋白，该检测容易产生假阴性结果。

作为新一代分子POCT平台，Pluslife Mini Dock以其紧凑的尺寸、快速的处理速度、高准确性和成本效益，为初级医疗机构和患者提供了新的分子检测解决方案。目前，尚无公开数据比较Pluslife、EasyNAT和Wondfo这三种检测试剂盒。本研究的目的是确定Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒的性能特征，并评估其与RT-qPCR临床诊断的一致性。此外，通过将其性能与EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒和Wondfo 2019-nCoV抗原检测试剂盒进行比较，评估Pluslife SARS-CoV-2检测试剂盒的临床实用性。

MATERIALS AND METHODS

The Pluslife Rapid SARS-CoV-2 assay used in this study

本研究使用的Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测卡在集成的核酸检测设备Pluslife Mini Dock上运行。该检测基于等温扩增方法和酶切探针技术，能够特异性检测SARS-CoV-2的N基因和ORF1ab基因。在等温系统中扩增时，会产生大量靶基因序列拷贝。当荧光标记的探针与互补序列杂交时，它会被切割，从而产生荧光信号。Pluslife Mini Dock检测并分析荧光信号，自动报告阳性、阴性或无效结果。

操作流程包括：将一次性采样拭子插入核酸释放剂中以释放SARS-CoV-2核酸；然后将400–450 μL的SARS-CoV-2核酸释放液滴入SARS-CoV-2反应卡样本管中；拧紧管盖后，按下卡盖顶部的气按钮以溶解反应芯片中的珠子，随后垂直摇晃卡盒10次（约5秒内）；最后将卡盒插入集成核酸检测设备中启动检测程序。检测过程通常需要约15–35分钟。

Analytical performance evaluation of the Pluslife Rapid SARS-CoV-2 assay

使用SARS-CoV-2核酸定量检测参考品进行绝对定量，通过稀释参考品（1.0×10¹⁰ copies/mL）得到七个浓度（800, 600, 500, 400, 300, 200, 和 100 copies/mL），每个浓度测试20个重复。LOD定义为达到≥95% SARS-CoV-2靶基因阳性检测率的最低浓度。

针对常见呼吸道病原体系统评估了交叉反应性，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、甲型流感病毒(IAV)、乙型流感病毒(IBV)、EB病毒(EBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(HMPV)、人副流感病毒(HPIVs)和人巨细胞病毒(HCMV)。每种病毒样本进行重复测试，一致阴性结果证明该检测具有特异性。

在低SARS-CoV-2浓度下评估了干扰物质的影响。外源性干扰物质包括奥司他韦(1.875 mg/L)、头孢曲松(1.125 g/L)、利巴韦林(16.5 mg/L)、美罗培南(235 mg/mL)、妥布霉素(30 mg/L)，以及内源性干扰物质如人血(0.16% vol/vol)。所有测试结果均为阳性，表明所测试物质均无干扰。

Evaluation of the clinical performance of the Pluslife Rapid SARS-CoV-2 assay

Clinical samples

本研究回顾性分析了2023年9月至11月期间中山大学附属第一医院门诊和急诊科197例疑似COVID-19感染患者的鼻咽拭子样本。这些样本储存在-80℃备用，并使用商业RT-qPCR试剂盒进行SARS-CoV-2检测。RT-qPCR作为SARS-CoV-2检测的金标准。首先根据RT-qPCR结果确定阳性和阴性样本，然后使用三种快速SARS-CoV-2检测方法对每个样本进行测试：Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测、EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测和Wondfo新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原检测。比较这些检测方法的临床性能。

本研究使用了临床环境中获得的剩余生物样本。邀请有COVID-19检测医嘱的患者参与，并获得所有参与者的口头知情同意。研究方案经中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准。

SARS-CoV-2 detection

所有检测均按照制造商说明进行。作为金标准的RT-qPCR检测使用商业试剂盒，整个过程包括核酸提取、RNA逆转录为互补DNA，以及使用ABI7500系统进行实时定量PCR扩增。取200 μL UTM样本，使用核酸提取或纯化试剂盒处理。每个RT-PCR反应使用5 μL核酸洗脱液。如果ORF1ab或N基因的循环阈值(Ct值)≤40，则定义为阳性结果。

EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测使用Ustar的核酸扩增检测分析仪进行。将1 mL涡旋混合的2019-nCoV-RNA提取溶液和0.5 mL样本加入样本室。密封卡盒盖，轻轻摇晃卡盒以确保溶液和样本充分混合，最后将卡盒插入检测分析仪进行分析。

Wondfo 2019-nCoV抗原检测使用Wondfo抗原检测卡进行。将鼻咽拭子样本插入样本提取溶液中并旋转10次以确保充分溶解，然后向检测卡的样本孔中加入3–4滴（80 μL）混合物。在15–20分钟内判读结果。

Statistical analysis

使用阳性符合率(PPA)、阴性符合率(NPA)和总符合率(ORA)将Pluslife、EasyNAT和Wondfo检测试剂盒的测试结果与RT-qPCR进行比较。此外，计算Cohen's kappa (κ) 以评估每种检测方法与RT-qPCR之间的总体一致性。使用Wilson评分法计算置信区间(CI)。使用IBM SPSS Statistics 25进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学显著性。

RESULTS

Analytical performance of the Pluslife assay

为确定Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测的LOD，制备了不同浓度的标准品稀释液并按说明书进行测试。LOD确认为400 copies/mL。为进一步评估交叉反应性，该检测针对其他呼吸道病毒进行了测试，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、IAV、IBV、EBV、RSV、HMPV、HPIVs和HCMV。结果显示与这些呼吸道病毒无交叉反应，表明对SARS-CoV-2具有高特异性。浓度高达所列水平的干扰物质对检测性能无干扰。

Clinical performance of three Rapid SARS-CoV-2 assays

总共对197份鼻咽拭子样本进行了RT-qPCR和三种快速SARS-CoV-2检测（Pluslife、EasyNAT和Wondfo）的SARS-CoV-2检测。相对于RT-qPCR参考标准的综合一致性指标见表4，按Ct值分层的详细检测率见表5，不一致结果分析见表6。54份RT-qPCR确认的阳性样本的Ct值范围为22–40。

与RT-qPCR相比，Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测的PPA为96.30%，NPA为99.30%。ORA为98.48%，两种检测方法表现出高度一致性 (κ=0.962, P<0.001)。Pluslife检测对Ct值<30的样本实现了100%的阳性检出率，对Ct值30–40的样本检出率>93%。有三份样本结果不一致：两份RT-qPCR阳性样本（N基因或ORF1ab基因Ct值超过35）经Pluslife检测为阴性，一份RT-qPCR阴性样本经Pluslife检测为阳性。

同样，与RT-qPCR相比，EasyNAT Rapid SARS-CoV-2检测的PPA和NPA分别为96.30%和98.60%。ORA为97.97%，结果高度一致 (κ=0.949, P<0.001)。EasyNAT检测对Ct值<30的样本检出率为100%，对Ct值30–35的样本为93.10%，对Ct值≥35的样本为100%。有四份样本结果不一致：两份RT-qPCR阳性样本（N基因或ORF1ab基因Ct值>35）经EasyNAT检测为阴性，两份RT-qPCR阴性样本经EasyNAT检测为阳性。

对于Wondfo 2019-nCoV抗原检测，与RT-qPCR比较显示PPA为81.48%，NPA为100.00%。ORA值为94.92%，表现出良好一致性 (κ=0.865, P<0.001)。Wondfo检测的检出率对于Ct值<25为100.00%；Ct值25–30为93.75%；Ct值30–35为86.21%；Ct值≥35为28.57%。有十份样本在Wondfo检测和RT-qPCR之间结果不一致，其中九份样本的Ct值超过33。

Comparison of the three Rapid SARS-CoV-2 assays

三种快速SARS-CoV-2检测方法在54份RT-qPCR阳性样本上的临床性能比较详见表7。在这些阳性样本中，三种方法分别检出52例(96.30%)、52例(96.30%)和44例(81.48%)阳性。结果显示存在显著差异 (χ²=10.008, P<0.05)。Pluslife检测的阳性率与EasyNAT检测相匹配。两两比较显示，两种分子检测（Pluslife和EasyNAT）与基于抗原的检测（Wondfo）之间存在统计学显著差异，两种分子检测均表现出显著更高的阳性率。

值得注意的是，虽然Pluslife和EasyNAT检测在检测阳性样本方面效果相当，但EasyNAT检测需要昂贵的台式仪器和复杂的实验室基础设施。相比之下，Pluslife Mini Dock体积更小、更经济，且结果更快（阳性：约7分钟 vs 40分钟）。此外，Pluslife检测在每台设备和每次检测成本方面具有明显的经济优势，使其更具便携性、更快且成本效益更高。此外，Pluslife检测与Wondfo检测之间的差异具有统计学显著性。Pluslife检测的PPA比Wondfo检测高出约15%。当N基因或ORF1ab基因的Ct值超过35时，Wondfo检测更容易漏检阳性样本。

DISCUSSION

冠状病毒病2019 (COVID-19) 仍然是流行性呼吸道感染的主要原因之一。目前，最广泛接受的SARS-CoV-2诊断检测仍基于金标准方法RT-qPCR。然而，实验室RT-qPCR检测在许多国家仍难以普及，无法在资源有限的环境中广泛实施。尽管快速抗原检测提供了便利，但其灵敏度不如分子检测。近年来，新兴的等温扩增技术（如CPA、RPA）使得便携式分子诊断成为可能，但大多数商业系统对于床旁使用来说仍然成本高昂。本研究评估了新型Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒（一个手掌大小的POCT平台）的性能，使用RT-qPCR作为参考方法，并与已建立的检测方法：EasyNAT Rapid SARS-CoV-2分子POCT和Wondfo 2019-nCoV GICA进行了比较分析。

Pluslife Rapid SARS-CoV-2检测试剂盒表现出低至400 copies/mL的LOD。它对其他常见呼吸道病毒无交叉反应，且不受测试物质的干扰，显示出良好的诊断性能。对于临床样本，Pluslife检测与RT-qPCR之间存在良好的一致性 (κ=0.962, P<0.001)。使用Pluslife检测，阳性样本最快可在7分钟内确定，而阴性样本可在约35分钟内确认。其快速、准确、用户友好和成本效益高的特点符合POCT标准，使其适用于初级保健和资源有限的环境。

此外，本研究首次对Pluslife、EasyNAT和Wondfo三种检测试剂盒进行了比较分析。以RT-qPCR作为金标准，Pluslife检测的PPA达到96.30%，与EasyNAT检测的96.30%一致，并优于Wondfo检测的81.48%。在NPA方面，Pluslife检测的准确度为99.30%，超过了EasyNAT检测(98.60%)。值得一提的是，在197份临床样本中，Pluslife检测的ORA为98.48%，超过了EasyNAT检测(97.97%)和Wondfo检测(94.92%)，表明其具有更优的临床可靠性。对于RT-qPCR阳性样本，统计分析显示三种检测方法之间存在显著差异 (χ²=10.008, P<0.05)。两两比较揭示了两种分子检测（Pluslife, EasyNAT）与Wondfo抗原检测之间存在显著差异。

分子POCT的出现对于呼吸道疾病的快速诊断和鉴别起着关键作用。在本研究比较的两种快速SARS-CoV-2分子POCT检测中，Pluslife检测表现出比EasyNAT检测更优的性能，具有检测性能好、尺寸紧凑、成本低、操作简单和结果快速等优点。此外，与Wondfo检测（检测病毒表面蛋白）不同，Pluslife Mini Dock在几分钟内指数级扩增SARS-CoV-2 RNA，显著降低了假阴性的可能性。

本研究存在几个局限性。首先，使用RT-qPCR结果而非临床疾病诊断作为金标准。RT-qPCR的可靠性可能受到不完整临床随访数据的影响。RT-qPCR结果可能无法准确反映样本的SARS-CoV-2携带状态。因此，本研究使用PPA和NPA而非灵敏度和特异性来表征快速SARS-CoV-2检测与RT-qPCR相比的临床性能。此外，未进行病毒基因组测序，无法评估变异影响。而且，样本量较小，且大多数阳性样本的Ct值超过35。这可能是PPA值未达到Laura Herrmann研究中提供的99% PPA值的原因。最后，临床样本未同时使用所有四种方法进行测试，并且在重复冻融过程中，储存在-80℃的样本中的SARS-CoV-2可能已降解。

总之，Pluslife检测与RT-qPCR具有良好的一致性。与EasyNAT检测相比，Pluslife检测在SARS-CoV-2阳性样本的检测效率上同样出色，且具有更小的尺寸、更低的成本和更快的检测速度。与Wondfo检测相比，Pluslife检测的临床性能更为突出，假阴性率更低。Pluslife Mini Dock的紧凑设计、便携性、简单操作、快速检测能力和成本效益支持其在资源有限环境中进行SARS-CoV-2筛查的应用。

ACKNOWLEDGMENTS

我们衷心感谢中山大学附属第一医院检验科和急诊科的教职工在样本收集中提供的帮助。

本研究由广东省新型冠状病毒肺炎防治科技攻关项目(2023B1111010003)支持。