APOE基因型与性别驱动人源化小鼠肠道微生物群标准化后的分化研究

《mSphere》：APOE genotype and sex drive microbiome divergence after microbiome standardization in APOE-humanized mice

本研究通过标准化肠道微生物群（GMB）的人源化APOE小鼠模型，首次揭示了APOE基因型与性别因素如何驱动微生物群落随年龄发生特异性分化。采用浅层鸟枪法测序实现物种水平分辨率，发现APOE2携带者（尤其雌性）富集抗炎相关的毛螺菌科（Lachnospiraceae）细菌，而APOE3个体则与晚发性阿尔茨海默病（LOAD）相关的Turicibacteraceae菌科增多。该研究为APOE基因相关疾病（如心血管疾病和神经退行性疾病）的微生物靶向治疗提供了关键物种级证据。

　　

摘要

APOE⁴等位基因是散发性或晚发性阿尔茨海默病（LOAD）最明确的遗传风险因素。肠道微生物群（GMB）失调可能导致疾病预后恶化。性别、APOE基因型、炎症和肠道微生物之间的相互作用尚未被完全阐明。先前对人类和人源化APOE小鼠的研究已证实APOE基因型特异的GMB差异，但多数研究未能实现细菌物种水平的分辨。APOE基因型背景下GMB如何随年龄和性别变化仍不明确。本研究通过将携带APOE 2、3或4基因型的人源化雄性小鼠与相同的两只C57BL/6J雌鼠繁殖，以标准化各品系间的微生物群，并监测基于APOE等位基因的分化。在育种建立时收集粪便样本，并从杂合子（F1）和纯合子（F2）后代在断奶时和6月龄时收集。通过浅层鸟枪测序评估粪便，以实现物种和菌株水平的分类学分辨率。所有基因型的杂合子幼鼠在断奶时微生物群相似，但杂合子幼鼠及其纯合子后代持续分化，尤其是APOE2雌性。在纯合子小鼠中，GMB在6月龄时基于性别和APOE基因型表现出显著分化。与APOE3和APOE4对应个体相比，APOE2雌性和雄性显示出与抗炎特征相关的细菌数量增加，包括毛螺菌科（Lachnospiraceae bacterium UBA3401），以及Turicibacteraceae科细菌数量减少（该科细菌水平较高与LOAD相关）。

重要性

APOE⁴等位基因是许多疾病的重要风险因素，包括心血管疾病（导致死亡人数超过任何其他疾病）和散发性或晚发性阿尔茨海默病（占所有痴呆病例的估计60%–80%）。已知肠道微生物群受不同基因型和疾病状态的影响。小鼠模型研究具有环境和遗传控制，允许研究特定基因。本研究旨在发现关键的GMB物种差异，为未来的治疗靶点提供依据。实验小鼠的GMB被标准化，并观察到基因型和性别特异性的分化，具有物种甚至菌株水平的分类学分辨率。本文报道了首批数据，证明来自遗传来源的APOE基因型随时间驱动GMB分化，并且是首批识别APOE基因型特异性细菌物种的数据，这些细菌可能作为APOE驱动疾病中的治疗靶点。

引言

载脂蛋白E（ApoE）是一种在大脑中大量存在的脂质货物结合蛋白，由免疫细胞产生并与免疫细胞相互作用，已被证明影响肠道微生物群（GMB），并与多种疾病相关。在人类中，ApoE有三种主要亚型：ApoE2、ApoE3和ApoE4，对应人群中的三个主要等位基因（APOE2、APOE3和APOE4）。APOE3是最常见的，APOE2和APOE4各包含一个点突变，导致从ApoE3亚型发生一个氨基酸改变。尽管亚型之间仅存在单个氨基酸变化，但不同的APOE基因型与多种生物学功能改变有关，包括改变的免疫和脂质结合以及改变的信号传导，并且与多种疾病风险增加相关，如阿尔茨海默病（AD）和心血管疾病（CVD）。

AD是一种使人衰弱的疾病，在美国影响约680万人，其中三分之二是女性，占所有痴呆病例的估计60%–80%。AD的特征是淀粉样蛋白β斑块和神经原纤维tau缠结的积累，这可导致各种认知症状，包括肌肉控制丧失、行为改变和记忆丧失。年龄是AD的最大风险因素，但遗传和环境因素也起作用。APOE4是散发性或晚发性阿尔茨海默病（LOAD）最著名的遗传风险因素，与APOE3纯合子个体相比，APOE4纯合子个体患AD的风险增加12倍。与免疫受体和脂质结合亲和力的亚型特异性差异已被牵涉到不同的疾病风险中。携带APOE4的AD患者显示更早的Aβ积累、更早的临床疾病发作、更快的疾病进展、更重的斑块负担和增加的脑萎缩，而携带APOE2的AD患者则表现出较晚的Aβ沉积、较晚的临床发作和增加的寿命。

CVD是一个日益增长的健康问题，是全世界导致死亡人数最多的疾病（13%）。APOE基因型与CVD之间的联系部分归因于改变的结合亲和力和脂质运输导致胆固醇、HDL和LDL水平改变。此外，已知肠道微生物群在CVD中起作用，包括肠道微生物群衍生的血浆代谢物循环三甲胺-N-氧化物与CVD和心脏相关事件风险增加之间的关联。这种代谢物的循环（在AD中也升高）导致炎症反应并增加血管炎症。

性别、APOE基因型、炎症和肠道微生物群的相互作用尚未被完全理解。已知基因型可以驱动GMB变化，而GMB对健康至关重要。一些先前的研究表明APOE基因型与不同的GMB谱、炎症和不同的疾病状态相关。然而，关于APOE基因型作为微生物群变化驱动因素的机制研究以及能够识别分类群到物种水平的研究缺乏。Hammond等人在55-85岁具有不同APOE基因型的人类中鉴定了基因型依赖的共生细菌物种差异，其他几项人类研究也确定了科或属水平的变化。先前评估APOE和GMB的小鼠研究使用16s rRNA将微生物群鉴定到科水平，并且没有使用跨品系标准化微生物群的小鼠来评估基因型的真实影响。需要物种水平的分辨率来识别哪些细菌驱动炎症并确定免疫微生物治疗靶点，因为同一科内的不同细菌可能具有不同的炎症特征。

在此，我们提出一项研究，调查APOE基因型在驱动人源化靶向替换小鼠GMB分化中的作用，这些小鼠携带APOE 2、3或4，允许在受控环境中评估基因型特异性影响，而没有影响人类GMB的外部因素（饮食、运动、环境等）。已知具有独立谱系的动物，即使在同一设施内，也表现出不同的肠道微生物群组成，微生物群标准化的一种方法包括将不同谱系或基因型的小鼠回交到同一母亲。在本研究中，我们将APOE 2、3和4小鼠分别回交到相同的C57BL/6J姐妹，以研究在APOE基因型背景下，标准化的和遗传的GMB如何随年龄和性别变化，并识别APOE基因型特异性细菌物种，这些细菌可能作为APOE驱动疾病中微生物群调节的靶点。

材料与方法

本研究使用了四种小鼠品系：人源化APOE2 [B6.Cg-Apoe^tm2/J (品系: 029017)]、人源化APOE3 [B6.Cg-Apoe^tm3/J (品系: 029018)]、人源化APOE4 [B6(SJL)-Apoe^tm4/J (品系: 027894)]以及内部维持的C57BL/6J (B6; 品系: 000664)。内部维持的品系定期从杰克逊实验室（JAX）更新以减少遗传漂变。APOE 2、3和4小鼠从JAX购买。小鼠饲养在超级屏障小鼠房内的独立通风和空气过滤的笼子中。所有笼子、垫料、食物、水和丰容材料在与小鼠接触前均经过高压灭菌或紫外线处理。所有笼子仅在生物安全柜中打开，人员穿着高压灭菌的实验服和无菌手套。小鼠自由获取食物、水和丰容材料。所有研究遵循批准的机构动物护理和使用委员会协议、《实验室动物护理和使用指南》以及《公共卫生服务实验室动物人道护理和使用政策》。

微生物群标准化

两只B6雌性同窝仔首先与一只APOE4雄性繁殖，然后与一只APOE2雄性繁殖，再与一只APOE3雄性繁殖，产生携带人APOE 2、3或4基因杂合的后代（N1代）。相同基因型的杂合N1小鼠被饲养在一起，并选择纯合子幼鼠为每种基因型生成标准化微生物群品系（N1F1及后续世代）。因为我们使用相同的B6母亲进行标准化，不能同时将三只雄性放在同一个笼子里；因此，存在必要的年龄差异。为确保基因型之间的年龄差异尽可能小，B6母亲在上一窝幼鼠断奶后立即与下一只雄性建立繁殖（确保它们没有怀上前一只雄性的幼鼠，并对幼鼠进行基因分型）。所有基因型的杂合子（N1）和纯合子（N1F1及后续世代）种鼠均在8周龄时建立繁殖。为了解释笼间效应，为每种基因型收集的用于微生物群评估的样本均来自多个笼子的小鼠。所有小鼠饲养在同一饲养架上，每种性别和每种基因型使用2-3个笼子。

粪便收集

在育种建立时（8周龄）从B6母亲和APOE 2、3和4父亲收集粪便颗粒。从N1杂合子后代在断奶时、7周龄和6月龄收集粪便颗粒，并从纯合子后代（N1F2代）在断奶时和6月龄收集。所有人员穿着高压灭菌的实验服和无菌手套进行粪便收集。小鼠笼仅在生物安全柜中打开。将小鼠单独放入空的高压灭菌笼中进行粪便收集，以确保每个样本的正确识别。将粪便颗粒放入无菌的2 mL螺旋盖管中，并在-80°C储存，直至运送到Transnetyx，并在运输前转移到室温稳定储存缓冲液（Transnetyx微生物组样本收集试剂盒）中。

浅层鸟枪测序

使用浅层鸟枪测序以增加测序深度并实现物种和菌株水平的分类学分辨率。将粪便装在DNA稳定缓冲液中运送到Transnetyx进行提取、文库制备和测序。使用独特的双索引适配器将基因组DNA转化为测序文库，以确保读长和/或生物体不会被错误比对。使用Qiagen DNeasy 96 PowerSoil Pro QIAcube HT提取试剂盒和方案进行DNA提取。使用具有独特双索引的适配器将基因组DNA转化为测序文库，以确保读长和/或生物体不会被错误比对。使用Watchmaker DNA文库制备与片段化方案进行文库制备。使用Illumina NovaSeq仪器和方案进行测序，深度为2百万对2 × 150 bp读长。使用One Codex分析软件分析原始数据（FASTQ文件形式），使用包含超过127,000个完整微生物参考基因组的One Codex数据库。将微生物样本与One Codex数据库进行比较包括三个连续步骤：使用k-mer（k=31）通过精确比对将每个单独序列与数据库进行比较；基于唯一k-mer的相对频率过滤掉序列伪影；基于每个可用参考基因组上的测序深度和覆盖度估计每个微生物物种的相对丰度。总体而言，读长的平均分类率为71%，平均73%分类到物种水平，总读长中少于4%来自宿主。

过滤

使用R版本4.3.2处理数据。为了解释样本间文库大小的差异，使用microbiomeStat（v1.2.0）R包对数据进行二次抽样和标准化。首先，移除分配给宿主物种（小家鼠）或未注释微生物物种的读长计数。接下来，使用最大阈值为三百万读长计数进行稀释，然后使用总规模标准化（Total Sums Scale）方法进行标准化。使用每个时间点和合子性组内至少0.005%的丰度阈值过滤微生物物种，并过滤仅包括存在于总雄性或雌性样本数至少20%中的物种。选择三百万读长阈值进行稀释，以由于样本间文库大小的差异而均衡所有时间点的统计功效。在标准化前后通过将批次作为变量添加到PERMANOVA模型中来测试稀释后的批次效应，并确认稀释后没有批次效应，且结果在二次抽样阈值间一致。

统计分析

通过使用“base”R包的prcomp函数进行主成分分析（PCA）来评估样本的聚类。通过使用“vegan”R包（v. 2.6.8）的adonis函数并选择“Bray-Curtis”方法计算成对距离，进行PERMANOVA检验来测试群落组成差异。使用“coda4microbiome”R包（v.0.2.4）的coda_glmnet函数估计微生物特征。使用Galaxy Metabiome Portal进行线性判别分析效应大小（LEfSe）和代表来自6月龄纯合子和杂合子小鼠LEfSe数据的Cladogram，以比较人源化APOE 2、3和4小鼠之间的GMB。对于LEfSe分析，执行Kruskal-Wallis检验（P < 0.05）以测试不同类别中的值是否分布不同。使用Wilcoxon检验（P < 0.05）检查不同类别内的子类，以观察它们是否符合类别水平的趋势。将大于2的阈值应用于线性判别分析得分。使用了最严格的形式，即使用All-against-All方法（多类方法）。这产生了一个向量子集，从中构建线性判别分析模型。特征根据它们区分类别的能力（效应大小）进行排名，在子类分组中保持一致，并且关于类别具有判别性。使用One Codex平台生成细菌物种丰度和香农多样性图。使用Prism 10版本10.1.1生成带有双因素ANOVA随后进行Tukey多重比较检验的点图，并显示多重性调整后的P值。

结果

杂合子APOE2、APOE3和APOE4幼鼠、它们的B6母亲及其各自的纯合子APOE2、APOE3和APOE4父亲的前30种细菌物种的GMB探索性平均相对丰度图显示，幼鼠的GMB与它们各自的父亲不 closely resemble。对杂合子APOE2、APOE3和APOE4雌性幼鼠及其B6母亲和各自的纯合子APOE2、APOE3和APOE4父亲进行的探索性PCA显示，雌性幼鼠在断奶时基于GMB组成聚集在一起，GMB组成无统计学显著差异。对父母及其雄性幼鼠进行的另一项探索性PCA显示，雄性幼鼠的GMB组成在断奶时表现出一些分化，主要由APOE4幼鼠驱动，存在统计学显著差异。杂合子APOE 2、3和4幼鼠从断奶到6月龄显示出不一致性，并且没有恢复到它们父亲（购买的纯合子APOE 2、3和4雄性）的微生物群。到6月龄时观察到杂合子幼鼠基于基因型的分化。比较6月龄APOE合子性小鼠中性别特异性GMB变化的PERMANOVA显示，携带APOE4等位基因的纯合子或杂合子雄性小鼠之间无统计学显著差异，携带APOE3等位基因的小鼠也无显著差异，而APOE2小鼠基于合子性存在统计学显著差异。当比较6月龄雌性小鼠的合子性时，APOE4小鼠在纯合子和杂合子小鼠之间表现出显著差异，而APOE3小鼠基于合子性趋于显著，APOE2小鼠通过PERMANOVA检验无显著差异。将杂合子小鼠繁殖以产生纯合子实验品系，并追踪GMB至6月龄。进一步评估基因型特异性差异的重点放在6月龄纯合子小鼠上。

纯合子幼鼠在断奶时和6月龄时与它们的祖父（购买的纯合子APOE 2、3和4雄性）的平均相对细菌丰度和PCA图比较显示，幼鼠与它们的祖父持续分化。基于香农指数的α多样性在杂合子或纯合子雌性和雄性小鼠的APOE 2、3或4基因型之间没有显著差异。几种细菌物种，尤其是毛螺菌科中的物种，在6月龄时在纯合子APOE 2、3和4小鼠之间具有显著不同的丰度。在6月龄的纯合子雌性中，GMB因基因型而异，APOE2雌性表现出最大的GMB分化。在雄性中，基因型之间的GMB组成也存在显著差异，但不如雌性小鼠的分化明显。

为了研究基因型之间的微生物群差异，使用LEfSe来指示驱动基因型组成差异的细菌物种，通过将统计学显著性检验（P < 0.05和倍数变化>2）与生物学一致性相结合。Cladogram展示了LEfSe数据的可视化表示，显示了6月龄纯合子和杂合子APOE 2、3或4雌性和雄性小鼠按基因型的GMB系统发育关系。6月龄纯合子APOE 2、3和4雌性小鼠的LEfSe和相应的Cladogram表明，APOE4雌性拥有最多数量的基因型特异性物种，而APOE3雌性则拥有来自最不同科的物种。APOE2雌性相关的细菌物种以毛螺菌科内的物种为主（占物种的43%），并且与它们的APOE3和APOE4雌性对应个体相比，毛螺菌科的总体丰度更高。与LOAD相关的细菌科Turicibacteraceae仅与APOE3小鼠（雄性和雌性）相关，并且在APOE2小鼠中总体丰度最低。在雄性中，APOE2小鼠表现出最多数量的基因型相关细菌物种，毛螺菌科代表了指示APOE2基因型的细菌的47%，并且与它们的APOE3和APOE4对应个体相比，毛螺菌科增加。进行了coda4microbiome分析，这是选择性平衡（Selbal）分析的一种更新方法，以发现预测基因型的微生物特征。coda4microbiome分析使用一个对数对比模型，正值对应于A组（例如APOE3），负值对应于B组（例如APOE4），零值对应于两者都不（不属于微生物特征）。使用coda4microbiome分析与LefSe分析相比，识别了相似的细菌物种作为每种性别和基因型的指示物种。

讨论

GMB有助于免疫系统发育，是营养可用性和吸收所必需的，参与宿主代谢，并有助于多种疾病的进展或延迟。随着GMB与宿主中日益增多的疾病相关联，了解GMB如何根据基因型和性别变化有潜力帮助疾病诊断、预防和治疗。针对患者的GMB治疗已经作为艰难梭菌感染的粪便微生物群移植（FMT）进行，并作为AD治疗进行测试。由于存在未知病原体物种的风险（免疫受损患者尤其易感），制定微生物群药丸而非使用FMT的兴趣日益增加。需要关注特定有益细菌物种及其与遗传风险因素和疾病关系的研究。

GMB对APOE基因型和性别的反应尚未被充分探索。许多因素影响GMB，使得人类微生物组研究相关性困难，正如文献中关于细菌科与疾病进展（包括AD和CVD研究）关联的不一致所见。小鼠模型研究有潜力消除人类研究中看到的大部分随机效应和混杂变量。通过标准化微生物群并追踪基因型特异性变化，小鼠研究可能为人类中发现的和相关疾病的APOE基因型特异性GMB变化提供进一步证据，从而允许评估基因型作为GMB差异的驱动因素，而非相关性基因型研究。

标准化起始微生物群对于真正评估基因型特异性GMB变化非常重要。有多种方法已用于标准化小鼠的微生物群，包括共饲养、在出生时一起抚养幼鼠（抚养）、胚胎移植（ET）或将雄性转基因小鼠与背景品系的雌性野生型小鼠繁殖（母系遗传）。通过共饲养实验小鼠品系进行微生物群标准化尽管存在梳理行为和食粪行为，但存在局限性。没有关于何时以及共饲养多长时间的标准化方法，并且与非同窝仔共饲养对雄性小鼠具有挑战性。在出生时与抚养雌性一起抚养幼鼠也存在许多挑战，因为雌性只能照顾每个笼子中有限数量的幼鼠；时间必须精确，以便所有实验品系都准备好转移；必须有抚养雌性可用接收抚养幼鼠，并且存在与抚养幼鼠的护理和存活相关的挑战。ET涉及将胚胎植入假孕雌性体内，需要协调的时间安排和昂贵的手术。母系遗传被一些人认为是微生物群标准化的标准，因为它简单、快速，并且已被证明有效。本研究使用母系遗传来标准化GMB并产生实验性人源化转基因APOE 2、3和4小鼠品系。目标是消除独立小鼠谱系固有的随机变化，并在具有相同环境的受控环境中研究APOE基因型和性别特异性微生物群变化。使用浅层鸟枪测序追踪人源化转基因APOE 2、3和4小鼠在GMB标准化后至6月龄的GMB分化，达到物种水平。

在本研究中，购买了人源化APOE 2、3或4雄性转基因小鼠（C57BL/6J背景上的同源），并利用母系遗传。将人源化APOE 2、3和4转基因雄性分别与相同的两只C57BL/6J姐妹繁殖，以标准化幼鼠的微生物群。由此产生的杂合子APOE 2、3和4幼鼠的微生物群在断奶时彼此之间比它们各自的纯合子APOE 2、3或4父亲更相似。观察到杂合子幼鼠到6月龄时出现性别和基因型分化，但没有恢复到它们父亲（2-3月龄，JAX微生物群）的状态。在雌性中观察到比雄性更大的分化，APOE2雌性表现出最大的分化。纯合子后代继续显示基因型和性别特异性细菌GMB组成，没有恢复到它们的祖父（JAX微生物群），包括在先前人类AD患者研究中描述为有益（毛螺菌科）或与不良结局相关（Turicibacteraceae）的科中发现的几种细菌物种的差异。

在雌性中被证明指示基因型的细菌物种中，APOE4雌性有几种丁酸盐/短链脂肪酸（SCFA）生产者，以及Lachnospiraceae bacterium 28-4，这是一种需要其他细菌的SCFA并且对心脏代谢健康有益的细菌。APOE4雌性还增加了Kineothrix sp. 000403275（一种从发炎小鼠中回收的细菌）和Acetatifactor muris（一种在肥胖小鼠中发现的细菌）的丰度。APOE2雌性增加了已知产生有益代谢物的毛螺菌科物种的丰度，包括Lachnospiraceae bacterium UBA3401。最后，APOE3雌性增加了通常被认为与健康相关的物种的丰度，包括Oscillibacter sp. 1-3、Muribaculum sp. 002492595和Lachnospiraceae bacterium A4，以及一种与抗衰老相关的细菌物种Dubosiella newyorkensis。然而，在雄性小鼠中观察到不同的趋势。尽管APOE4雄性表现出Acetatifactor muris的增加，类似于APOE4雌性，但它们在丁酸盐/SCFA生产者Kineothrix MGBC162921以及健康相关细菌Oscillibacter sp. 1-3和Dubosiella newyorkensis方面表现出差异，类似于APOE3雌性。APOE3雄性与丁酸盐/SCFA生产者相关，包括Acetatifactor MGBC129690和Lachnospiraceae bacterium A4。最后，APOE2雄性也表现出特定丁酸盐/SCFA生产者的增加，即Kineothrix MGBC130615，但也表现出Muribaculum sp. 002492595和Akkermansia muciniphila的增加，这些细菌与较低的血管炎症相关。APOE2雄性与具有益生菌功能且与人类植物性饮食相关的细菌丰度增加相关。许多已识别的物种尚未研究其潜在功能和对健康与疾病的影响。然而，这些结果表明，一些特定的细菌改变可能在人源化APOE转基因小鼠中研究其与疾病的功能相关性。此外，几种这些细菌也存在于人类中，或者具有已知的人类同源物。额外的细菌功能研究将提供关于影响宿主的代谢物、人类中相应的细菌物种以及它们与其他细菌相互作用的敏锐度。

香农多样性在APOE基因型之间没有显示GMB物种多样性的显著差异。最大和最快的分化在APOE2雌性中观察到，其高丰度的Lachnospiraceae bacterium UBA3401和3404是分化的驱动因素。Lachnospiraceae bacterium UBA3401被认为是一种高度有益的细菌，有可能通过代谢物帮助清除艰难梭菌感染。APOE4雌性是唯一与Blautia属细菌增加相关的组，这些是已知的SCFA生产者，并且是唯一具有高水平Lachnospiraceae bacterium 28-4的组。Blautia虽然是SCFA生产者，但也与血压升高、脑脊液中更差的淀粉样蛋白β比率相关，并且可以是肠道屏障完整性的指标。有趣的是，Lachnospiraceae bacterium 28-4已知在存在较高水平SCFA时会增加，但本身不产生它们，进一步代表了不同细菌物种的代谢物增加或减少其他细菌存活率的相互作用。APOE3雌性和APOE2雄性表现出与它们同性对应个体相比最广泛细菌科的基因型特异性变化。先前的人类、小鼠和细菌研究认为少数细菌科通常对所有人都有益，包括毛螺菌科的成员和SCFA生产者，这些在我们的研究中也发现发生了改变。

已知性激素影响GMB、基因型和疾病进展。在这里，我们证明APOE基因型对雌性的影响大于雄性，并且一些在雌性中指示一种基因型的细菌物种在雄性中指示不同的基因型。许多在科或属水平识别细菌的研究对于哪些细菌是已知疾病的指标存在分歧，这可能是由于性别、实验开始时的GMB以及特定物种的重要性所致，这些物种可能在存在或不存在特定基因的情况下改变其他细菌的存活率。

总体而言，与它们的APOE3和APOE4对应个体相比，APOE2雌性和雄性表现出抗炎特征相关细菌数量增加，包括毛螺菌科（Lachnospiraceae bacterium UBA3401, 3404），以及Turicibacteraceae减少，后者在先前的人类研究中与AD相关。一些已知的SCFA生产细菌物种因APOE基因型而异，不同物种与不同基因型相关。虽然梭菌科内的细菌数量和总体数量没有因基因型而变化，但Blautia属的细菌仅与APOE4雌性相关，表明需要物种水平的分辨率。我们的研究，像先前的研究一样，发现了与APOE小鼠相似的趋势，APOE4小鼠与通常被认为更具炎症性、指示更高脂肪和不良AD预后的细菌相关；然而，我们的研究是首个证明来自标准化遗传来源的GMB随时间由APOE基因型驱动分化，并利用浅层鸟枪测序实现物种水平分辨率的研究。

本研究有几个局限性。杂合子和早期纯合子时间点仅包括每种性别每种基因型三个样本，这限制了通过PERMANOVA检验检测微生物群组成微小差异的能力。此外，样本是分批测序的，这需要对数据进行标准化（总和标准化方法）。然而，评估了稀释后的批次效应，没有发现。N1F1代中纯合子的幼鼠不能用作本研究中的纯合子，因为它们被用作种鼠来产生我们的纯合子微生物群标准化群体。此外，繁殖可能改变了N1F1代的微生物群。因此，本研究调查了N1F2代，这是标准化后的一代。然而，来自6月龄杂合子的数据