嗜热古菌Saccharolobus islandicus中类真核泛素相关修饰蛋白Urm1的蛋白质修饰全景图及其功能研究

《mSystems》：Protein modification by a eukaryotic-like ubiquitin-related modifier in the hyperthermophilic archaeon Saccharolobus islandicus

本文报道了嗜热古菌Saccharolobus islandicus中类真核泛素相关修饰蛋白Urm1介导的蛋白质urmylation（Urm1修饰）的大规模体内研究。作者开发了一种高效方法（包括Urm1 H81R突变体构建、蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理和抗K-ε-Gly-Gly抗体亲和富集），鉴定出330个蛋白上的783个Urm1结合位点，揭示了广泛的多聚urmylation（poly-urmylation）现象。研究证实urm1基因对细胞存活至关重要，其敲低导致生长迟缓和细胞分裂蛋白（CdvB/CdvB1/CdvB2）水平显著下降，提示Urm1在细胞分裂等关键过程中发挥重要作用，为真核生物Ub/Ubl系统的古菌起源假说提供了有力证据。

　　

摘要

尽管古菌中真核生物Urm1（泛素相关修饰蛋白-1）的同源物已被鉴定，但其真正的底物和功能仍知之甚少。本研究报道了在嗜热古菌Saccharolobus islandicus中，利用一种高效方法对Urm1修饰进行的蛋白质组学分析。该方法包括在该菌株编码的Urm1中引入H81R替换、用蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理菌株，以及肽段分级分离后使用抗K-ε-Gly-Gly抗体亲和富集urmylated肽段。观察到广泛的蛋白质urmylation，在细胞中总共鉴定出映射到330个蛋白质的783个Urm1结合位点。Urm1中的七个赖氨酸残基中有六个是修饰位点，其中K7和K37被优先修饰。用蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理后，K37连接的链成为唯一的主要修饰物种，表明K37连接是蛋白酶体降解的主要触发因素。被修饰的蛋白质参与多种细胞过程，如细胞分裂、染色体组织、DNA复制、翻译、蛋白酶体蛋白质降解和硫传递。蛋白质urmylation是动态的，并受生长条件和应激处理的影响。尝试删除urm1未成功，表明该基因是必需的。urm1的敲低导致显著的生长延迟，在此期间细胞分裂蛋白（CdvB, CdvB1, CdvB2）的细胞浓度急剧下降。我们的结果显著揭示了古菌中蛋白质urmylation的全景图和潜在作用。

引言

泛素（Ub）和相关的泛素样蛋白（Ubls）能够共价连接到多种细胞蛋白质靶标上，在真核细胞中协调各种调控过程。泛素是一种保守的76个氨基酸长的多肽，采用明确定义的β-抓握折叠。通过E1、E2和E3酶的级联反应，数千种底物可以通过异肽键被泛素化，这一过程被特定的去泛素酶逆转。泛素化研究最深入的作用之一是其蛋白酶体介导的蛋白质水解中的关键功能。泛素可以作为单体或具有不同结构拓扑的多聚泛素链连接到其他蛋白质上。值得注意的是，K48连接的链是蛋白酶体降解最常见的信号，而K63连接的链在应激下含量丰富。除了在蛋白质周转中的作用外，泛素还作为翻译后信号调节各种细胞过程和途径，包括DNA损伤应答、细胞周期进程、蛋白质运输、细胞凋亡和先天免疫。此外，细胞中的游离泛素对细胞存活至关重要，游离泛素水平的降低会损害酵母和小鼠的生存能力。

真核生物Urm1是Ubls的一员，它与原核硫转移蛋白ThiS和MoaD在结构和氨基酸序列上均具有同源性，被认为是连接真核生物Ub/Ubl家族与祖先原核硫转移蛋白之间进化“缺失环节”的候选者。与泛素类似，Urm1在真核生物中高度保守。虽然大多数Ubls以无活性的前体形式合成，需要在与底物结合前进行蛋白酶切割，但Urm1直接作为成熟蛋白质产生，无需蛋白酶切割。与泛素化通过明确的三步酶促过程（E1-E2-E3级联）进行不同，urmylation似乎不那么复杂，仅需要E1样酶来产生共价修饰的底物。目前尚不清楚urmylation过程是否可逆，因为迄今为止尚未发现能够逆转Urm1结合的蛋白水解活性。与泛素化相反，urmylation似乎不是一种聚合修饰，因为在任何真核细胞中均未观察到多聚urmylation。Urm1是一种双功能蛋白，除了形成蛋白质结合物外，还作为硫载体调节tRNA硫醇化修饰。与泛素相比，Urm1的蛋白质底物较少，在不同的真核生物中仅鉴定出少数到几十种底物蛋白质。最著名的底物是硫氧还蛋白过氧化物酶Ahp1。Urmylated的过氧化物酶Ahp1和tRNA硫醇化都有助于Urm1在氧化应激应答中的功能。Urm1在Saccharomyces cerevisiae中是非必需基因，但删除该基因会导致对各种应激源的敏感性，包括营养剥夺、高温和氧化剂处理。

Ubls最初被认为仅限于生命的真核域。2010年，在Haloferax volcanii中首次鉴定出古菌的真正泛素样修饰。H. volcanii中的三种泛素样蛋白，即SAMP1、SAMP2和SAMP3，通过异肽键与靶蛋白结合，仅需要E1样UbaA酶，并且它们的修饰被JAB1/MPN/MOV34金属酶逆转。生物信息学和结构研究表明，SAMPs是真核生物Urm1的同源物。此外，生物信息学研究表明，SAMPs广泛分布于所有古菌门中。在H. volcanii中，通过体内外源过表达SAMPs后，分别鉴定出SAMP2、SAMP3和SAMP1的14、28和23个结合位点。许多已鉴定的靶蛋白与硫代谢和氧化应激有关。其中，E1样UbaA、SAMP2和SAMP3被sampylated，表明细胞中可以形成多聚SAMP链。ubaA、samp1、samp2和samp3在H. volcanii中不是必需的。在标准培养条件下，包括ubaA敲除以及Ubl基因（samp1、samp2和samp3）的单敲除或三敲除的突变菌株的生长与野生型菌株相似。

Urm1/SAMP同源物也在Sulfolobus acidocaldarius中得到表征。来自相关物种Saccharolobus solfataricus的Urm1同源物的晶体结构揭示了与真核生物Urm1蛋白和其他古菌SAMPs的相似性。通过使用体外方法总共鉴定出29种不同的底物，并且在体内过生产Urm1后观察到25种底物。在Urm1蛋白本身上也观察到修饰，表明可以形成聚合链。Urmylated的底物，包括修饰子本身，在体外被古菌蛋白酶体识别和处理。

在本研究中，我们开发了一种高效的方法，用于在Saccharolobus islandicus中全蛋白质组范围内分析其唯一Ubl同源物Urm1修饰位点。该方法需要构建一个编码带有H81R替换的Urm1的突变S. islandicus菌株，用蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理细胞，以及在肽段分级分离后使用抗K-ε-Gly-Gly抗体亲和富集urmylated肽段。通过这种方法，我们获得了迄今为止报道的最大的古菌Ubl底物体内数据集，包括S. islandicus中330个蛋白质的783个结合位点。Urm1中除K3外的所有七个赖氨酸残基都被修饰，表明细胞中存在多聚Urm1链。被修饰的蛋白质参与一系列生物过程，如细胞分裂、染色体组织、DNA复制、翻译、蛋白酶体蛋白质降解和硫传递。Urm1对S. islandicus的生存能力是必需的，urm1的敲低导致显著的生长延迟，并伴随细胞分裂蛋白（CdvB, CdvB1, CdvB2）细胞浓度的急剧下降。我们的数据提供了对Urm1介导的蛋白质修饰的全景图和动态的新观点，并为古菌中蛋白质urmylation的潜在作用提供了线索。

材料与方法

实验设计和统计原理

对S. islandicus urm1 H81R菌株蛋白质组中的Urm1结合位点进行了三次独立分析。数据使用MaxQuant（v.1.6.15.0）进行分析，并使用严格标准鉴定修饰肽段，详细的参数设置在后文关于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析和数据分析的部分提供。由于实验的技术难度，每次实验获得的数据量有限。因此，使用三次实验中得出的最大数据集来最大化修饰位点的鉴定。对于KEGG通路富集分析，进行了P值<0.05的Fisher精确检验。使用双尾未配对t检验对对照组和urm1敲低菌株的细胞直径进行统计分析。

生物体生长

Saccharolobus菌株通常在75°C、150 rpm摇动的SCVy培养基中生长。S. islandicus E233S（ΔpyrEF, ΔlacS）在补充有尿嘧啶（20 μg/mL）的SCVy中生长。urm1沉默菌株在ACVy培养基中生长以诱导urm1的沉默。在ACVy培养基中，阿拉伯糖替代了SCVy培养基中的蔗糖，这促进了质粒转录，随后诱导了urm1的沉默。

urm1 H81R菌株的构建

通过将来自urm1基因且邻近H81密码子的间隔序列（5′-TAAATCATGGTGGTTAGAGATATCGAAGGTTCAAGTAAGT-3′）和侧接urm1基因的供体DNA序列克隆到pSeRp中，构建用于将点突变（H81R）引入urm1（SiRe_1713）的基因组编辑质粒，如先前所述。然后使用相应的突变引物对依次突变供体片段中的PAM位点和H81密码子，产生质粒pGE-urm1。通过电穿孔将质粒pGE-urm1导入S. islandicus E233S。在SCVy平板上生长的转化细胞首先通过PCR扩增进行筛选。随后通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析所得的PCR产物。通过反复划线纯化所需的突变菌株，称为urm1 H81R。

urm1敲低菌株和对照菌株的构建

从urm1基因序列中选择一个在3′端带有原型间隔相邻序列（PAS）基序的原型间隔。将间隔片段插入pSeRp的BspMI位点，产生pAC-urm1-kd。通过电穿孔用pAC-urm1-kd转化S. islandicus E233S，获得urm1沉默菌株。通过用pSeRp转化S. islandicus E233S构建对照菌株。筛选在SCVy平板上生长的转化细胞，并通过反复划线纯化目标菌株。

用于测定Urm1结合蛋白质组的样品制备

突变菌株urm1 H81R在含有尿嘧啶（20 μg/mL）的SCVy培养基中于75°C、150 rpm摇动生长。在OD₆₀₀为0.3时收获细胞，重悬于裂解缓冲液（8 M尿素，1%蛋白酶抑制剂混合物[Roche]，3 M曲古抑菌素A，50 mM烟酰胺，和2 mM EDTA）中，并在冰上超声处理。对于实验3，在OD₆₀₀为0.3的细胞用10 μM Bortezomib处理8小时，重悬于裂解缓冲液，并在冰上超声处理。在4°C下以20,000 × g离心30分钟后，上清液中的蛋白质用冰冷的20%三氯乙酸（TCA）在4°C沉淀2小时。在4°C下以15,000 × g离心10分钟后，用冷丙酮洗涤沉淀三次。将蛋白质溶解在8 M尿素和50 mM NH₄HCO₃中，并使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。用5 mM二硫苏糖醇（DTT）在56°C下还原蛋白质溶液30分钟，随后在23°C黑暗中使用11 mM碘乙酰胺烷基化15分钟。加入50 mM NH₄HCO₃将尿素浓度降至2 M后，以胰蛋白酶与蛋白质质量比1:50加入胰蛋白酶并孵育过夜。

将每个所得消化物的一部分（实验1和2分别为2 mg和4 mg蛋白质）脱盐，真空干燥，并重悬于免疫沉淀（IP）缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 和0.5% NP-40）中。对于实验3，胰蛋白酶肽（16 mg蛋白质）通过高pH反相高效液相色谱（HPLC）在C18柱上分级分离成72个级分。将这些级分合并成四个池，真空干燥，并溶解在IP缓冲液中。每个池的肽段分别进行肽段富集，并在4°C下与预洗的抗K-ε-Gly-Gly抗体珠粒温和摇动孵育过夜。为了去除非特异性结合的肽段，用1 mL IP缓冲液洗涤珠粒四次，并用去离子H₂O洗涤两次。通过用0.1%三氟乙酸洗涤三次来洗脱肽段。将洗脱的级分合并，真空干燥，并通过C18 ZipTips脱盐。

LC-MS/MS分析和数据分析

LC-MS/MS分析在nanoElute超高效液相色谱（UPLC）系统上在线耦合到timsTOF Pro质谱仪上进行。将肽段上样到自制的填充有C18树脂的15 cm无筛板柱上，并以450 nL/min的流速用溶剂A（0.1%甲酸和2%乙腈水溶液）到溶剂B（0.1%甲酸乙腈溶液）的梯度洗脱：6%到42% B超过42分钟，24%到32% B超过14分钟，32%到80% B超过2分钟。洗脱的肽段在timsTOF Pro质谱仪上进行分析。MS采集在数据依赖的平行积累-串联碎裂（PASEF）模式下操作，一个完整帧中包含10个PASEF MS/MS帧。毛细管电压设置为1.6 kV，MS和MS/MS谱图采集范围从100到1700 m/z。动态排除设置为30秒。

使用MaxQuant（v.1.6.15.0）和集成的Andromeda搜索引擎处理原始质谱文件。将串联质谱图与Uniprot S. islandicus REY15A数据库以及反向诱饵数据库进行搜索。前体离子的质量容差在首次搜索和主搜索中设置为20 ppm，碎片离子的质量容差设置为20 ppm。指定Trypsin/P为切割酶，允许最多四个漏切位点。最小肽段长度设置为7。通过将肽段隔离因子（PIF）设置为0.75来采用干扰过滤器。将羧甲基化（C）设置为固定修饰，而乙酰化（N端）、氧化（M）和GlyGly（K）设置为可变修饰。错误发现率调整为1%。使用P值<0.05和得分>40的截断值鉴定修饰肽段。定位概率设置为>0.75。

生物信息学分析

使用MoMo软件分析所有鉴定出的Urm1结合位点序列。基于arCOG数据库进行arCOG注释。使用BlastKOALA进行KEGG注释，并使用P值（Fisher精确检验）<0.05的截断值识别显著富集的通路。使用STRING进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。

免疫印迹

细胞在8%–18%梯度SDS-PAGE凝胶中进行电泳。将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜首先与指定的兔抗体孵育，然后与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔抗体孵育。加入增强化学发光Western blot底物后，使用Tanon 5200多化学发光系统观察目标蛋白质。本研究中制备了针对Urm1的抗体。针对CdvB、CdvB1和CdvB2的抗体由山东大学的教授提供。

透射电子显微镜（TEM）

用2%（wt/vol）乙酸铀酰染色细胞，并在JEM-1400 TEM下观察。使用ImageJ软件测量细胞的直径。

结果

Urm1结合位点的蛋白质组范围鉴定

我们首先建立了一个鉴定Urm1结合位点的程序。该程序涉及使用抗K-ε-Gly-Gly特异性抗体富集urmylated肽段。与泛素通常在两个C末端甘氨酸残基之前包含一个赖氨酸或精氨酸残基，允许胰蛋白酶消化后在修饰位点暴露二甘氨酰残余不同，几乎所有的Urm1同源物，包括来自S. islandicus的同源物，在两个C末端甘氨酸残基之前编码一个组氨酸。虽然糜蛋白酶可以切割组氨酸残基羧基末端的肽键，但切割效率极低，使得糜蛋白酶消化不适合旨在鉴定Urm1结合位点的蛋白质组学方法。由于精氨酸的PTMs远少于赖氨酸，我们将S. islandicus Urm1中两个C末端甘氨酸残基之前的组氨酸H81突变为精氨酸，以允许胰蛋白酶有效切割。H81R突变不影响细胞生长，也未导致S. islandicus的Urm1结合物谱发生显著变化。因此，我们在H81R突变菌株中进行了所有三个大规模蛋白质组学实验（实验1-3）。

我们还确定了蛋白酶体抑制剂Bortezomib对细胞中蛋白质urmylation水平的影响。我们发现，随着细胞暴露于蛋白酶体抑制剂Bortezomib超过2.5至25小时的时间，Urm1结合物的强度逐渐增加。使用10或50 μM的Bortezomib处理增强了Urm1结合物的整体强度，但没有产生新的结合物。此外，我们发现当分析更多量的蛋白质时，获得了更多的Urm1结合物。这些发现促使我们修改实验3的方案，包括用Bortezomib预处理细胞、使用更多的细胞蛋白质以及肽段的预富集分离。

如图2A所示，实验3揭示了比另外两个实验（实验1和2）更多的修饰位点。此外，实验1和2中发现的位点几乎全部包含在实验3中。这些结果表明了测定的可靠性和可重复性，但也表明已鉴定的Urm1结合位点的数量可能仍然被低估，因为它随着分析的样品蛋白量的增加而增加。来自Urm1的二甘氨酰基序通过异肽键连接到修饰位点赖氨酸残基的ε-氨基上，例如两个代表性的MS²谱图所示，即映射到CdvB1（SiRe_1550）的VVEAQMSK^GGDTQR和映射到Urm1（SiRe_1713）的EIDVSDK^GGELFNVLLK。在三个实验中，总共鉴定出783个独特的Urm1结合位点，映射到330个蛋白质，包括679个位置明确的位点和104个位置模糊的位点。相比之下，在系统发育上接近S. islandicus的S. acidocaldarius中，通过体外和体内方法组合仅鉴定出47个蛋白质中的62个Urm1位点。值得注意的是，S. islandicus中这些位点有778个，对应311个蛋白质，是先前未报道的。

大约97%（319/330）的urmylated蛋白质包含不超过六个结合位点，其中具有单个位点的蛋白质最为丰富（56%，185/330）。六个蛋白质，即甘氨酸-tRNA连接酶（SiRe_1559）、过氧化物氧化还原酶家族/AhpE样亚家族（SiRe_2592）、谷氨酸脱氢酶（SiRe_0689）、延伸因子1-α（SiRe_1776）、热休克蛋白60（SiRe_1214）和热休克蛋白60（SiRe_1716），在超过10个位点被urmylated。两个urmylated的热休克蛋白60被修饰得最为广泛，修饰位点数量分别达到31个（SiRe_1214）和35个（SiRe_1716）。值得注意的是，检测到单个肽段中两个或三个位点同时被urmylated。为了确定赖氨酸urmylation的序列偏好，我们检查了每个urmylated赖氨酸从-10到+10位置的序列。在所有鉴定出的urmylated肽段中，15.5%在-2位置存在保守的丙氨酸或苏氨酸，11.5%在-3位置存在保守的谷氨酸。

Urm1靶蛋白的特征

为了深入了解蛋白质urmylation在S. islandicus生理学中的作用，我们使用arCOG类别、KEGG通路和STRING相互作用网络分析检查了已鉴定的底物。arCOG类别分析显示，Urm1底物在翻译、核糖体结构和生物合成（arCOG J）中显著富集。总共有46个核糖体蛋白被urmylated，占基因组编码的总核糖体蛋白的72%。修饰蛋白在细胞代谢中也富集，特别是在能量产生和转换（arCOG C）、氨基酸转运和代谢（arCOG E）、转录（arCOG K）、翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣（arCOG O）中。八个分子伴侣，包括三个Hsp60家族热休克蛋白60（SiRe_1214、SiRe_1716和SiRe_2245）、小热休克蛋白Hsp20（SiRe_0216）、前折叠素β亚基（SiRe_1279）、硫氧还蛋白（SiRe_1631）和两个过氧化物氧化还原酶家族蛋白（SiRe_2592和SiRe_0067），是优先修饰的靶标。两个过氧化物氧化还原酶家族蛋白都是酵母过氧化物氧化还原酶Ahp1的同源物，表明S. islandicus Urm1可能在氧化应激应答中发挥作用。一些来自硫传递系统的蛋白质，包括Moco生物合成中的MoaE-MoaD融合蛋白（SiRe_0186）、硫胺素生物合成中的硫转移酶ThiI（SiRe_1665）和tRNA 2-硫尿苷生物合成中的硫转移酶TusA（SiRe_0659）也被urmylated。

KEGG通路分析确定了四个显著富集的通路，即核糖体、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、TCA循环和碳固定通路。除了核糖体，其余三个通路都涉及能量代谢。使用STRING数据库进行的蛋白质-蛋白质相互作用分析将Urm1结合靶标聚类成几个独特的功能网络。与arCOG和KEGG分析结果一致，核糖体代表最大的簇。此外，许多Urm1底物与碳代谢网络相关，其中包括TCA循环、碳固定通路和丙酮酸代谢的蛋白质。Urm1底物也在与免疫应答、嘌呤生物合成、脂肪酸代谢过程、硫氧还蛋白样超家族和甘油醛氧化还原酶活性相关的网络中发现。

特别令人感兴趣的是观察到细胞分裂蛋白CdvA（SiRe_1173）、CdvB1（SiRe_1550）和CdvB2（SiRe_1200）分别在一个、三个和四个位点被urmylated。参与Urm1结合途径的蛋白质，如Urm1（SiRe_1713）、E1样酶Uba4p（SiRe_1697）以及蛋白酶体α亚基（SiRe_1271）和β亚基（SiRe_1237）也被修饰。小核酸结合蛋白Cren7（SiRe_1111）、Sis10b（SiRe_1125）、Sis10b2（SiRe_1123）、Sul7d（SiRe_0668，SiRe_2648）和SSB（SiRe_0161）在两个到八个赖氨酸残基上被修饰。这些修饰蛋白与各种基本生物过程相关，包括细胞分裂、染色体组织、DNA复制、翻译、蛋白酶体蛋白质降解和硫传递。

多聚urmylation

发现许多Urm1肽段被二甘氨酰基序修饰，表明存在丰富的Urm1连接。检测到七个Urm1赖氨酸残基中六个的连接，每个位点的代表性MS²谱图如图所示。为了评估每个连接位点的占有率，我们分析了其分数强度，这是衡量特定位点连接对Urm1总连接贡献的指标。在我们的生长条件下，修饰显示出对K7和K37的强烈偏好，对K48的中等偏好，以及对K58和K32的低偏好。有趣的是，在存在Bortezomib的情况下，K37连接变得 overwhelmingly 占主导地位，表明这种连接通过蛋白酶体触发蛋白质降解。此外，K24连接似乎仅在Bortezomib处理后出现。结构作图显示，所有六个Urm1连接位点都暴露在Urm1的表面，而K3是唯一未修饰的赖氨酸残基，埋藏在蛋白质内部。空间位阻可能解释了K3缺乏修饰的原因。序列比对显示，最优先修饰的位点K7和K37是高度保守的，其他位点在Saccharolobus和Sulfolobus Urm1蛋白中是中度保守的。因此，一个位点的修饰程度取决于其序列保守性和结构可及性。

urmylation对生长条件和应激处理的响应

在H. volcanii和酵母中，Ubls修饰受生长条件和应激处理的影响。为了确定蛋白质urmylation的生长依赖性谱，我们在SCVy培养基中不同生长阶段收集S. islandicus细胞，并使用抗Urm1抗体通过免疫印迹检测细胞中的Urm1结合物。死亡期的蛋白质urmylation模式与对数期和稳定期显著不同。虽然一些蛋白质在整个生长周期中同样被urmylated，但其他蛋白质更依赖于生长阶段。游离Urm1在对数期和稳定期丰富，但在死亡期消失，表明游离Urm1的存在与细胞活性之间可能存在联系。

我们还确定了不同生长条件和处理对细胞中蛋白质urmylation的影响。细胞在最小培养基中生长至对数期，使用葡萄糖、阿拉伯糖或蔗糖作为碳源。这些细胞中蛋白质urmylation的总体模式相似，只是在阿拉伯糖存在下，一个未鉴定的约40 kDa蛋白质比在葡萄糖或蔗糖存在下更严重地被urmylated。然后，我们用各种氧化剂处理指数生长的细胞，包括温和氧化剂二甲基亚砜、强氧化剂H₂O₂、百草枯、N-乙基马来酰亚胺和diamide。Diamide是唯一能显著增加Urm1结合物整体强度同时降低细胞中游离Urm1水平的试剂。由于diamide已知能特异性氧化蛋白质中的硫醇形成二硫键，我们的结果表明蛋白质urmylation对硫醇氧化敏感。

S. islandicus的urm1敲低菌株的特征

为了研究urmylation的生理功能，我们尝试创建urm1或uba4p缺失突变体。然而，这些努力没有成功，表明这两个基因对生物体的生存能力是必需的。这与Zhang等人在密切相关的菌株S. islandicus M.16.4中进行的必需性测定结果一致。因此，我们通过将靶向urm1的间隔序列克隆到在阿拉伯糖启动子控制下的基因编辑质粒中，并转化S. islandicus，