基于亲水相互作用模式的治疗性寡核苷酸提取分离与测定方法开发

《Analytica Chimica Acta》：Development of a hydrophilic interaction-based procedure for the extraction, separation, and determination of therapeutic oligonucleotides

本文开发了基于亲水相互作用色谱（HILIC）的分散式固相萃取（dSPE）与LC-MS联用技术，首次实现了血清中不同长度修饰寡核苷酸（ONs）的高效提取（回收率>75%）与分离分析，为基因治疗药物代谢研究提供了全新解决方案。

　　

亮点

基于亲水相互作用模式的治疗性寡核苷酸提取、分离与测定方法开发

结果与讨论

本研究中的寡核苷酸（ONs）选择主要基于努西内森（nusinersen）药物的研究背景。测试的ONs序列为努西内森类似物的较短片段。此外，研究涉及两种结构元素的修饰：核糖2'-位引入甲氧基的2'-O-甲基化修饰，以及磷酸基团中氧原子被硫取代的硫代磷酸酯（phosphorothioation）修饰。同时测试了不同长度的ONs：从超短链（3-5聚体）到长链（12-14聚体）。

结论

我们首次开发了基于亲水相互作用的分散式固相萃取（dSPE）与液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术，用于修饰治疗性寡核苷酸（ONs）的提取、分离与测定。该方法采用新型合成的酰胺基吸附剂进行dSPE，并通过亲水相互作用色谱（HILIC）与串联质谱（MS/MS）对提取的ONs进行分析。

基于保留行为研究结果可知：两性离子固定相（SP）对短链ONs具有优异选择性且能有效抑制非对映异构体分离。但长链ONs（>10聚体）在该柱上存在洗脱难题，而酰胺柱凭借更稳定的色谱性能（测试参数对色谱行为影响较小）和更好的长链分离能力被选为最优方案。质谱参数优化重点解决了碱金属加合物形成导致的灵敏度降低问题。验证后的方法成功应用于富集血清提取物分析——新型酰胺基吸附剂通过弱离子交换机制（pH调控吸附/解吸过程）实现≥75%的回收率（RSD<5%）。