温和提取条件下燕麦与鹰嘴豆蛋白的结构功能导向制备及其与豌豆蛋白的对比研究

《Applied Food Research》：Structure-Function Guided Production of Oat and Chickpea Protein Isolates in Comparison to Pea Protein Isolate Following Mild Extraction Conditions

本研究针对植物蛋白功能特性不足及规模化生产难题，通过温和碱溶酸沉法（AE-IEP）成功实现了燕麦蛋白（OPI）和鹰嘴豆蛋白（ChPI）的实验室及中试规模制备。结果表明，该工艺能有效维持蛋白质结构完整性，显著提升规模化产品（SUPPI、SUChPI、SUOPI）的溶解性和凝胶强度，其中SUOPI的凝胶性能甚至优于商业豌豆蛋白。研究为开发功能性燕麦和鹰嘴豆蛋白原料提供了可规模化的技术路径，对植物蛋白市场多元化具有重要意义。

　　

随着全球人口预计在2080年达到103亿，对蛋白质的需求持续攀升，植物蛋白作为可持续资源备受关注。然而，当前植物蛋白市场严重依赖大豆蛋白，其转基因生物（GMO）状态、致敏性及潜在健康风险促使产业界寻求豌豆蛋白等替代品。但豌豆蛋白存在溶解度低、凝胶性和乳化性较差等功能局限，而鹰嘴豆和燕麦蛋白的研究与商业化应用仍处于起步阶段，尤其是其规模化提取工艺及功能特性调控机制尚不明确。传统高强度碱提取工艺易破坏蛋白质结构，导致功能劣化。因此，开发温和且可规模化的提取技术，以生产高功能性的新型植物蛋白原料，成为行业迫切需求。

在此背景下，明尼苏达大学食品科学与营养系的Brittany Kralik等研究人员在《Applied Food Research》上发表研究，系统评估了采用温和碱溶酸沉法（Alkaline Extraction coupled with Isoelectric Precipitation, AE-IEP）在实验室和中试规模下生产燕麦蛋白分离物（Oat Protein Isolate, OPI）、鹰嘴豆蛋白分离物（Chickpea Protein Isolate, ChPI）和豌豆蛋白分离物（Pea Protein Isolate, PPI）的可行性，并对比分析了其结构特性与功能性能。

研究团队采用的关键技术方法主要包括：利用AE-IEP工艺进行蛋白质的提取与纯化（包括碱性溶解、等电点沉淀、透析等步骤）；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）分析蛋白质分子量分布与聚合情况；采用差示扫描量热法（DSC）测定蛋白质变性温度和焓值；通过zeta电位和荧光光谱法评估蛋白质表面电荷和疏水性；利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析蛋白质二级结构；并通过溶解度测定、凝胶强度测试、扫描电子显微镜（SEM）观察凝胶形态以及乳化容量测定等功能性实验综合评价蛋白质性能。研究原料为供应商提供的商品化豌豆粉、脱脂鹰嘴豆粉和脱脂燕麦粉。

3.1. AE-IEP提取对蛋白质纯度和得率的影响

研究人员首先在实验室规模（benchtop）优化了OPI、ChPI和PPI的AE-IEP提取条件（豌豆和鹰嘴豆提取pH为7.5，燕麦提取pH为9.0）。结果表明，所有实验室制备的蛋白分离物纯度均达到85-95%，蛋白得率在45.8%至59.2%之间，证明了温和双溶出AE-IEP工艺的有效性。随后，在中试规模（pilot scale）进行放大生产，获得了规模化蛋白分离物（SUOPI, SUPPI, SUChPI）。比较发现，SUPPI和SUChPI的蛋白纯度与实验室产品无显著差异，但SUOPI的纯度显著低于实验室OPI，这主要归因于中试设备在分离燕麦蛋白上清液和残渣（含淀粉和β-葡聚糖）时面临挑战，导致杂质残留。在得率方面，放大生产后三种蛋白的得率均有所下降，其中豌豆蛋白得率的下降尤为显著，这同样与中试设备和工艺的差异有关。尽管如此，该研究首次证实了温和AE-IEP工艺可成功放大用于生产高纯度的鹰嘴豆和燕麦蛋白分离物，且目标在于保持蛋白质结构完整性以获取理想功能特性。

3.2. 蛋白分离物的结构特性

3.2.1. 蛋白谱与分子量分布

SDS-PAGE和SE-HPLC分析显示，实验室制备的PPI、ChPI和OPI均保留了其主要的天然蛋白组分（如豌豆和鹰嘴豆的伴豌豆球蛋白/豌豆球蛋白，燕麦的12S球蛋白）。与实验室产品相比，中试规模的SUPPI和SUChPI在非还原条件下电泳图谱的上部出现拖尾现象，表明在巴氏杀菌、蒸发和喷雾干燥过程中形成了通过二硫键连接的高分子量（HMW）聚合物。而SUOPI的蛋白谱与OPI无明显差异，表明燕麦蛋白在放大过程中聚合程度较低。商业豌豆蛋白分离物（cPPI）和大豆蛋白分离物（cSPI）则显示出更广泛的HMW聚合物和更严重的天然蛋白条带缺失，表明其经历了更剧烈的加工变性。SE-HPLC进一步证实，中试产品中可溶性聚集体的相对丰度高于实验室产品，但低于商业参考样品，说明温和AE-IEP放大工艺有效控制了蛋白质的过度聚合。

3.2.2. 蛋白质变性状态

DSC分析表明，实验室制备的PPI、ChPI和OPI均显示出明确的蛋白质变性吸热峰，表明其天然结构得到较好保留。中试规模生产的蛋白分离物（SUPPI, SUChPI, SUOPI）的变性总焓值显著低于其对应的实验室产品，表明放大过程中的热处理导致了部分变性。然而，这些中试产品的变性焓值仍显著高于完全变性的商业cPPI和cSPI（后者未观察到变性峰）。特别值得注意的是，SUChPI和SUOPI的变性总焓值高于SUPPI，这与鹰嘴豆中11S豌豆球蛋白和燕麦中12S球蛋白含量较高且热稳定性更强有关。结果证实，所采用的AE-IEP工艺能够成功放大生产OPI和ChPI，避免了蛋白质的完全变性和过度聚合。

3.2.3. 蛋白质表面性质

表面疏水性测量显示，实验室OPI的疏水性高于PPI和ChPI。放大生产后，所有三种蛋白分离物的表面疏水性均显著增加，这是由于热处理导致蛋白质部分变性，疏水基团暴露。然而，SUPPI和SUChPI的表面疏水性仍显著低于cPPI。表面电荷（zeta电位）分析表明，在pH 7.0时所有样品均带净负电荷。放大生产后，PPI和ChPI样品的净表面电荷显著降低，这可能是由于可溶性聚集体的形成屏蔽了部分电荷。而SUOPI的净表面电荷未发生显著变化，与其较少的聚集体形成一致。

3.2.4. 蛋白质二级结构

ATR-FTIR分析显示，与实验室产品相比，中试规模蛋白分离物（SUPPI, SUChPI, SUOPI）的分子间β-折叠含量显著更高，而β-折叠（包括平行和反平行）的相对丰度降低。这种变化与DSC结果一致，表明热诱导的二级结构转变，蛋白质发生部分展开和聚集。商业cPPI和cSPI则显示出最高比例的分子间β-折叠和最低的α-螺旋含量，证实了其更彻底的变性程度。

3.3. 蛋白分离物的功能特性

3.3.1. 蛋白质溶解度

在pH 7.0条件下，实验室ChPI的溶解度显著高于PPI和OPI。放大生产后，所有样品在pH 7.0下的溶解度均显著下降，这与蛋白质部分变性、表面疏水性增加以及HMW聚合物形成有关。尽管如此，SUChPI在非加热和加热条件下均保持了高溶解度，甚至优于SUPPI、SUOPI和所有商业参考样品（包括cSPI）。在pH 3.4（接近PPI和ChPI的等电点，但远离OPI的等电点）条件下，PPI和ChPI的溶解度降低，而OPI的溶解度则相对较高。放大生产对SUPPI和SUChPI在pH 3.4下的溶解度影响不显著，但对SUOPI的溶解度产生了明显的负面影响。总体而言，所有中试蛋白分离物的溶解度在加热条件下仍优于或相当于商业参考样品。

3.3.2. 凝胶强度与凝胶形态

凝胶强度测试表明，实验室ChPI的凝胶强度远高于PPI。放大生产显著增强了所有三种蛋白的凝胶强度，其中SUOPI的凝胶强度与cSPI相当，并优于cPPI、cChPC和SUPPI。SUChPI的凝胶强度也显著高于SUPPI。凝胶强度的提升归因于蛋白质部分变性、表面疏水性增加、可溶性聚集体形成以及分子间β-折叠含量增加等因素共同促进了蛋白质网络结构的形成。SEM图像显示，SUOPI和SUChPI的凝胶呈现出最复杂、最连续的网状结构，与其较高的凝胶强度相符。SUOPI的凝胶形态与cSPI相似，均为多孔致密结构。

3.3.3. 乳化能力

在实验室产品中，ChPI的乳化能力最高，OPI最低。放大生产后，PPI和ChPI的乳化能力下降，这与其HMW聚合物形成和表面性质变化有关。OPI的乳化能力在放大后未受显著影响。在所有样品中，cSPI的乳化能力最强。 among the scaled-up samples, SUChPI exhibited the highest emulsification capacity, which was comparable to that of cPPI.

结论与意义

本研究首次成功地将温和AE-IEP工艺放大应用于燕麦（谷物）和鹰嘴豆（豆类）蛋白分离物的生产，在保持蛋白质结构完整性的同时，获得了较高的蛋白纯度和可接受的得率。研究通过系统比较谷物蛋白（燕麦）与两种豆类蛋白（鹰嘴豆、豌豆），揭示了其结构功能特性在温和提取条件下的竞争优势。研究表明，规模化生产的SUPPI和SUChPI在溶解度方面优于或相当于商业cPPI和cSPI，而SUOPI则展现出优于SUChPI、SUPPI以及cPPI的凝胶强度。这些优异的性能与蛋白质独特的表面性质、可溶性聚集体的存在以及其固有的球蛋白特性密切相关。

该研究的重要意义在于：1）为功能性燕麦和鹰嘴豆蛋白原料的商业化生产提供了可行且可规模化的技术方案（温和AE-IEP）；2）证实了通过控制提取条件保护蛋白质结构是提升其功能特性的关键；3）凸显了燕麦蛋白在凝胶应用、鹰嘴豆蛋白在溶解性和乳化性应用方面的巨大潜力，为植物蛋白市场的多元化发展和食品配方的创新提供了新的优质原料选择。未来研究可聚焦于这些蛋白分离物的营养评价、风味特性及其在具体食品体系中的应用性能。