可注射透明质酸/纳米羟基磷灰石复合水凝胶：局部药物递送与骨修复的新策略

《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》：Injectable hyaluronic acid/nanohydroxyapatite composite hydrogels for localized drug delivery and bone repair

本研究针对骨质疏松性骨折修复中骨组织质量差、自愈能力有限等临床挑战，开发了一种可注射、可生物降解的复合水凝胶。该水凝胶由共价交联的透明质酸（HA）和纳米羟基磷灰石（nHAp）组成，并可负载雷奈酸锶（SrRan），实现了局部、持续的药物递送与骨修复双重功能。研究系统评估了nHAp含量（0-70 wt%）对水凝胶性能的影响，证实其具有剪切稀化行为、低注射力（< 2.5 N）及良好的体外细胞相容性。SrRan负载复合水凝胶能持续释放药物长达56天，为骨质疏松性骨缺损的微创治疗提供了有前景的新型生物材料平台。

　　

骨骼，作为人体的支撑结构，其健康至关重要。然而，随着年龄增长或疾病影响，骨骼会变得脆弱，尤其是骨质疏松症患者，其骨密度和骨质量下降，导致骨折风险显著增加。骨质疏松性骨折，特别是复杂形状的骨缺损，是临床面临的一大难题。由于骨组织质量差和自身再生能力有限，这类骨折的愈合过程往往缓慢且效果不佳。传统的治疗方法，如自体骨移植或商业骨移植替代品，其再生能力和治疗效果有限，尤其是在骨质疏松的骨环境中。更令人困扰的是，一些有效的抗骨质疏松药物，如雷奈酸锶（SrRan），虽然能促进骨形成并抑制骨吸收，但其口服生物利用度低（约25%），且高剂量（2克/天）长期使用会引发头痛、恶心、腹泻、胃肠道不适和皮肤过敏等全身性副作用，限制了其临床应用。因此，开发一种能够实现局部、持续给药，并同时支持骨修复的新型生物材料，成为骨科领域迫切的需求。

为了应对这一挑战，来自拉脱维亚里加工业大学的研究团队在《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》上发表了一项创新研究，他们开发了一种多功能的可注射复合水凝胶。这种水凝胶的核心成分是透明质酸（HA），这是一种天然存在于细胞外基质（ECM）中的糖胺聚糖（GAG），具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗炎活性，并能与骨细胞和生长因子相互作用，已被美国FDA批准作为注射填充剂使用。然而，HA本身缺乏成骨能力，对骨再生的支持不足。为此，研究人员将纳米羟基磷灰石（nHAp）引入HA网络中。nHAp是一种生物活性和生物相容性纳米材料，其化学和结构与人骨中的天然磷灰石非常相似，具有骨传导性，能促进成骨细胞粘附、增殖和分化，并诱导矿化和骨组织形成。更重要的是，nHAp由于其负电表面，还能作为药物载体。本研究创新性地将负载有SrRan的nHAp（SrRan-nHAp）整合到HA水凝胶中，旨在创建一个既能局部持续释放SrRan以治疗骨质疏松，又能为骨再生提供支撑平台的复合系统。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几个关键技术方法：首先，他们采用化学沉淀法合成了nHAp和SrRan-nHAp纳米颗粒。其次，利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为交联剂，通过其与HA的羧基（-COOH）反应，在水相温和条件下实现了HA的共价交联，形成水凝胶网络。这种EDC/NHS交联策略条件温和，副产物水溶性好、细胞毒性低，且能形成坚固可调的机械性能。再者，他们通过将预合成的nHAp或SrRan-nHAp悬浮液与预活化的HA溶液在相连的注射器中混合约100次，成功地将无机纳米颗粒均匀分散到水凝胶基质中，负载量高达70 wt%。此外，研究还综合运用了流变学分析、溶胀度与凝胶分数测定、酶促降解实验、药物释放动力学评估（UV-Vis光谱法）、扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以及体外细胞相容性测试（使用NIH3T3成纤维细胞和MC3T3-E1前成骨细胞进行浸提液和直接接触试验）等一系列表征技术，系统评估了复合水凝胶的理化性质和生物安全性。

3.1. 溶胀度和凝胶分数

研究结果显示，随着nHAp含量（从0%增加到70%）的增加，复合水凝胶的溶胀度显著降低（7天后从1542%降至269%），而凝胶分数则相应升高（最高达75%）。这表明nHAp的加入增强了水凝胶的网络结构。其原因在于nHAp中的钙离子（Ca²⁺）能与HA链上的羧基（-COO^-）和酰胺基（-CONH₂）形成配位络合物，使聚合物链更加紧密，增加了交联密度，从而减少了吸水膨胀的能力，同时提高了水凝胶的结构完整性和机械强度。

3.2. 体外酶促降解

在透明质酸酶作用下，所有水凝胶都能被完全降解。不含nHAp的水凝胶在24小时内完全溶解，而含有nHAp的复合水凝胶降解时间延长至2-5天，这可能是由于nHAp溶解导致局部pH轻微升高，增强了水凝胶的稳定性。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析降解产物，发现主要是低分子量的HA寡聚体，其中二糖约占88-89%。这些寡聚体具有生物活性，可刺激血管生成、成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积，从而有益于骨愈合过程。

3.3. SrRan释放

对负载SrRan的复合水凝胶（30%， 50%， 70% SrRan-nHAp）进行了长达56天的药物释放动力学研究。结果显示，在最初6小时内出现了61-68%的快速释放（突释效应），这归因于SrRan分子静电吸附在nHAp晶体表面。24小时后，从30%、50%和70% SrRan-nHAp水凝胶中分别释放了66%、73%和79%的SrRan；56天后，累计释放量分别达到71%、75%和82%。这表明更高的nHAp负载量能提供更多的药物释放。这种双相释放模式（初期快速释放促进早期成骨分化，后期持续释放）有利于骨修复。

3.4. 流变学表征

流变学测试证实所有水凝胶均表现出凝胶行为（储能模量G' > 损耗模量G''）。随着nHAp含量从0%增至70%，水凝胶的刚度（G'在1 Hz和0.2%应变下）从1.5 kPa增加至2.8 kPa，这一刚度范围被认为有利于间充质干细胞的增殖和成骨分化。水凝胶的凝胶时间（完全交联所需时间）在2至4小时之间，属于临床可接受的窗口期，便于手术操作。压缩测试也表明复合水凝胶在网络稳定性。

3.5. 可注射性

可注射性测试表明，所有水凝胶在合成后立即进行注射所需的力均低于2.5 N，远低于临床手动注射的最大允许力（30 N）和易注射性阈值（12 N），表明其易于手动注射。循环应变时间扫描测试显示，水凝胶在模拟注射后粘度恢复率在74%至89%之间，表明其具有良好的结构恢复能力。此外，所有水凝胶都表现出剪切稀化行为，即粘度随剪切速率增加而降低，这确保了其在注射时易于流动，注射后能迅速恢复形态，保持在骨缺损处的稳定性。

3.6. 体外生物相容性

根据ISO 10993-5标准，通过浸提液试验和直接接触试验评估水凝胶对MC3T3前成骨细胞和NIH3T3成纤维细胞的细胞毒性。结果表明，所有测试的水凝胶系列其细胞存活率均超过70%（毒性反应低于30%的阈值），因此被认为无细胞毒性。HA固有的生物相容性和nHAp的加入共同确保了该复合材料的安全性。

综上所述，本研究成功开发了一种基于EDC/NHS交联的透明质酸/纳米羟基磷灰石可注射复合水凝胶。该平台巧妙地结合了HA优异的生物相容性和nHAp的骨传导性与药物载体功能，并实现了治疗药物SrRan的局部持续释放。系统性的表征证实，该复合水凝胶具有可调的机械性能（刚度1.5-2.8 kPa）、良好的可注射性（注射力<2.5 N，剪切稀化，粘度恢复率高）、可控的酶促降解特性以及长达56天的持续药物释放能力。同时，体外实验证明了其对成骨相关细胞具有优异的生物相容性。这项研究不仅克服了在高负载无机纳米颗粒下保持水凝胶均匀性、可注射性和生物相容性的技术挑战，而且为骨质疏松等复杂骨缺损的微创治疗提供了一个集药物递送与骨修复于一体的多功能、有前景的生物材料平台，显示出巨大的临床转化潜力。