新型甲基氨基乙醇功能化β-环糊精纳米载体的构建及其对香芹酚的包载与抗菌/抗生物膜性能研究

《Carbohydrate Polymers》：Glucuronoxylans from Moringa oleifera and other wood species obtained by alkaline extraction: Modulation of uronic acid content depending on the dosage of sodium borohydride

本研究针对天然β-环糊精(β-CD)水溶性差、作为药物载体受限的问题，成功合成了一种新型水溶性β-环糊精衍生物(βCD-MEA)。该衍生物能自组装形成准球形纳米聚集体，可高效包载模型药物香芹酚(CAR)，形成的βCD-MEA/CAR包合物显著提高了CAR的水溶性和稳定性，并保留了其抗氧化、抗菌及抗生物膜活性。值得注意的是，空载βCD-MEA本身也显示出抗金黄色葡萄球菌生物膜的能力。该研究为开发兼具药物递送和内在抗菌活性的新型环糊精基纳米材料提供了新策略。

　　

在医药研发领域，如何提高难溶性药物的生物利用度是一个长期存在的挑战。环糊精（Cyclodextrin, CD）因其独特的“外亲水、内疏水”的环状结构，能够包合各种疏水性分子，从而改善药物的溶解性、稳定性和生物利用度，已成为一类重要的药物载体材料。其中，β-环糊精（β-CD）因其成本相对较低、空腔尺寸适中而应用最广。然而，天然β-CD自身水溶性较差，且其简单的羟基结构在功能上较为单一，限制了其作为高效药物载体的进一步发展。与此同时，细菌耐药性问题日益严峻，特别是细菌生物膜的形成，使得许多常规抗生素疗效大打折扣。因此，开发既能高效载药，又具备一定内在抗菌或抗生物膜活性的新型环糊精衍生物，成为药物递送和抗感染研究中的一个引人注目的方向。

在此背景下，一项发表在《Carbohydrate Polymers》上的研究报道了一种新型β-环糊精衍生物的设计、合成与性能研究。研究人员设想，如果在β-CD的初级羟基上引入多个具有生物活性的基团，是否能够一举两得：既改善其水溶性，又赋予其新的功能？他们选择了甲基氨基乙醇（Methylaminoethanol, MEA）作为修饰基团。氨基醇结构广泛存在于天然产物和生物活性分子中，能够参与氢键和离子相互作用，有时还具有靶向细菌细胞或穿透生物屏障的潜力。研究人员通过简单的亲核取代反应，将七个甲基氨基乙醇基团连接到商业可得的heptakis(6-碘-6-脱氧)-β-环糊精上，成功合成了七-(6-甲基氨基乙醇-6-脱氧)-β-环糊精（βCD-MEA），并对其结构、自组装行为、载药能力、生物相容性及抗菌抗生物膜活性进行了系统评价。

为开展此项研究，作者团队运用了多项关键技术方法。在合成与表征方面，采用了核磁共振波谱（NMR，包括一维和二维ROESY）、电喷雾电离高分辨质谱（ESI HR-MS）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对βCD-MEA的结构进行了确证。通过动态光散射（DLS）、电泳光散射（ELS）和原子力显微镜（AFM）分析了其在水中的自组装行为和纳米聚集体的形态尺寸。利用卤虫（Artemia salina）致死实验初步评估了其生物相容性。以香芹酚（Carvacrol, CAR）为模型药物，通过冷冻干燥法制备了βCD-MEA/CAR包合物，并采用相溶解度法研究了包合行为，计算了表观稳定常数（K_c）和包合效率（CE）。通过高效液相色谱（HPLC）测定了药物的载药量和包封率。采用分子模拟（使用xtb软件的GFN2-xTB方法和CREST工具）预测了包合物的最稳定构象。通过DPPH自由基清除实验评估了包合物的抗氧化活性。最后，通过测定最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）以及评估对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）生物膜形成和预成型生物膜的影响，系统评价了其抗菌抗生物膜效能。

3.1. βCD-MEA的合成与结构表征

研究人员通过商业可得的heptakis(6-碘-6-脱氧)-β-环糊精与过量的N-甲基乙醇胺反应，以80%的收率成功合成了目标化合物βCD-MEA。通过核磁共振氢谱（¹H NMR）、碳谱（¹³C NMR）、DEPT谱以及二维核磁（如ROESY）等技术对产物进行了详细表征，确认了甲基氨基乙醇基团的成功连接以及分子具有高度对称性。高分辨质谱（ESI HR-MS）检测到了符合七取代产物的多电荷离子峰，进一步证实了其结构。傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）显示βCD-MEA的O-H伸缩振动峰相较于天然β-CD发生位移，也间接证明了化学修饰的发生。

3.1.1. βCD-MEA的自聚集及水溶性纳米聚集体的形态分析

研究发现，βCD-MEA的水溶性显著高于天然β-CD（>100 mg/mL vs 18.5 mg/mL）。动态光散射（DLS）分析表明，βCD-MEA在水中能形成平均流体动力学直径约为248纳米、分布较窄（PDI ≈ 0.19）的纳米聚集体。zeta电位约为-46 mV，表明体系具有较好的胶体稳定性。原子力显微镜（AFM）图像显示这些聚集体呈准球形，平均高度约39.5纳米，宽度约108.6纳米，且在较高浓度下仍能保持相似的形貌。这种可变形性可能有利于其在体内的穿透。

3.1.2. βCD-MEA毒性的初步评估

采用卤虫（Artemia salina）致死实验进行初步毒性评估。结果显示，在所有测试浓度下，βCD-MEA均未引起卤虫死亡，其半致死浓度（LC₅₀）高于1.75 mg/mL，根据Clarkson毒性等级标准，表明该材料在测试范围内无明显毒性，具有良好的生物相容性前景。

3.2. βCD-MEA/香芹酚包合物的制备与表征

选择香芹酚（CAR）作为模型药物，通过冷冻干燥法成功制备了βCD-MEA/CAR包合物。测定其载药量为13%，包封效率高达85%。相比之下，不加βCD-MEA直接冷冻干燥的CAR损失极大，证明了βCD-MEA对CAR的有效包合与保护作用。

3.2.1. 通过NMR和ATR-FTIR光谱表征包合物

核磁共振氢谱对比显示，形成包合物后，CAR的芳香质子（H2, H4）和βCD-MEA空腔内质子（H3, H5）的化学位移均发生变化，提示发生了包合作用。二维ROESY谱中观察到CAR的芳香质子、异丙基质子与βCD-MEA空腔内质子（H3, H5）及N-CH₃质子之间存在相关信号，证实了CAR分子确实进入了βCD-MEA的空腔，且其异丙基倾向于朝向环糊精的窄口端。红外光谱也显示了包合物中CAR特征峰的位移，排除了简单物理混合的可能。

3.2.2. 分子模拟计算

分子模拟进一步支持了上述结论。通过GFN2-xTB方法优化和CREST构象搜索，得到了βCD-MEA/CAR包合物的最低能量构象。在该构象中，CAR的异丙基伸入空腔并指向窄口端，其芳香环与空腔壁存在相互作用，计算得到的原子间距离与ROESY实验结果相符。

3.2.3. 相溶解度研究

相溶解度实验显示，CAR的溶解度随βCD-MEA浓度增加呈线性增长（A_L型），表明形成了1:1化学计量比的包合物。计算得到的表观稳定常数（K_c）为1127 M^-1，高于文献报道的天然β-CD与CAR的包合物（155 M^-1），说明甲基氨基乙醇的引入增强了宿主与客体的相互作用。包合效率（CE）为7.55。

3.2.4. βCD-MEA/CAR包合物的尺寸和形态表征

DLS显示，载药后的纳米聚集体尺寸略有增大（平均直径约300纳米），PDI为0.22，zeta电位为-36 mV。AFM图像显示包合物仍保持准球形形态，平均高度和宽度分别为51.3纳米和97.6纳米，表明载药后纳米结构的基本形态得以维持。

3.2.5. βCD-MEA/CAR包合物的抗氧化活性

DPPH自由基清除实验表明，空载βCD-MEA本身无抗氧化活性。而βCD-MEA/CAR包合物中的CAR在0.2 mg/mL浓度下，其自由基清除率（约16%）与游离CAR在该浓度下的活性相当，证明包合过程并未显著影响CAR的抗氧化能力。

3.3. 微生物学研究

抗菌实验显示，βCD-MEA/CAR包合物与游离CAR对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）具有相似的最小抑菌浓度（MIC均为0.05-0.1 mg/mL），而空载βCD-MEA在所测最高浓度下无直接抗菌活性。这表明包合物中的CAR仍能有效发挥抗菌作用。在抗生物膜实验中，βCD-MEA/CAR和游离CAR均能显著抑制S. aureus生物膜的形成（在0.5×MIC浓度下抑制率约64-66%）。尤为重要的是，在针对预成型生物膜的实验中，βCD-MEA/CAR在较高浓度（1×MIC至4×MIC）下显示出比游离CAR更强的生物膜清除效果（例如在4×MIC时，包合物清除率75% vs 游离CAR 53%）。更令人惊讶的是，空载βCD-MEA本身也表现出剂量依赖性的抗预成型生物膜活性（在4×MIC浓度下清除率达84%），提示其分子中的氨基醇基团可能通过与生物膜基质成分相互作用，发挥了内在的抗生物膜效应。

本研究成功设计并合成了一种新型水溶性β-环糊精衍生物βCD-MEA。该衍生物能自组装形成尺寸均一、稳定性良好的准球形纳米聚集体，并表现出良好的生物相容性。研究表明，βCD-MEA能够高效包载疏水性药物模型香芹酚，形成稳定的纳米包合物。该包合物不仅显著提高了CAR的水溶性和稳定性，还完整保留了其抗氧化和抗菌活性。尤为突出的是，βCD-MEA/CAR包合物以及空载的βCD-MEA本身，均对金黄色葡萄球菌的生物膜，特别是难以清除的预成型生物膜，表现出显著的抑制和清除作用。这项工作不仅提供了一种性能改善的环糊精基药物载体，更重要的是展示了一种将药物递送功能与内在抗生物膜活性相结合的新策略。这种兼具“载体”与“武器”双重功能的智能材料，为应对细菌耐药性和生物膜相关感染提供了新的思路和候选材料，在“纳米抗生素”（Nanobiotics）这一新兴领域展现出广阔的应用前景。