Icariside II通过激活氧化应激诱导铁死亡和凋亡治疗非小细胞肺癌的机制研究

《Free Radical Biology and Medicine》：Icariside II Induces Ferroptosis and Apoptosis by Activating Oxidative Stress for Non-Small-Cell Lung Cancer Therapy

本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中单一程序性细胞死亡（PCD）诱导策略易产生耐药性的难题，开展了Icariside II（ICS II）诱导双PCD的机制探索。研究人员通过转录组学分析和功能验证，发现ICS II通过抑制Nrf2介导的SLC7A11/GPX4/HO-1转录和激活ACSL4介导的脂质过氧化，诱导线粒体功能障碍和氧化应激，同时激活caspase家族蛋白和降低PARP活性，最终触发铁死亡和凋亡。动物实验证实ICS II可有效抑制肿瘤生长且安全性良好。该研究为克服NSCLC治疗耐药提供了新的双PCD诱导策略，具有重要临床转化价值。

　　

肺癌作为癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的80-85%。尽管NSCLC的诊断和多模式治疗取得了显著进展，但其5年生存率仍然较低。程序性细胞死亡（PCD）诱导，如细胞凋亡，是NSCLC药物治疗的常见机制。然而，由于肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性，以诱导单一形式PCD为主要机制的治疗方案面临挑战。克服这些局限性对于提高NSCLC临床治疗的疗效至关重要。

氧化应激是细胞氧化和抗氧化系统之间的失衡，有毒产物损伤关键的细胞内成分，如脂质、蛋白质和DNA，最终导致细胞死亡。增加的氧化应激是肿瘤细胞的代谢特征，支持其对过氧化的易感性。因此，调节氧化还原稳态对于肿瘤发展和抗肿瘤治疗都至关重要。异常的氧化还原稳态与PCD密切相关，包括铁死亡和凋亡。因此，靶向氧化应激以诱导多重PCD并阻碍癌症发展可能具有治疗效果。

铁死亡是一种由铁依赖性不可控脂质过氧化驱动的PCD形式，其中过载的活性氧（ROS）氧化膜定位的多不饱和脂肪酸（PUFA），破坏膜结构。芬顿反应、酶促或非酶促脂质过氧化以及受损的天然抗氧化系统共同促成铁死亡。Nrf2介导的抗氧化途径是抵抗铁死亡的三大主要机制之一，它启动下游铁死亡抑制因子的转录，以保护细胞免受氧化损伤。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）是铁死亡的重要贡献者，它催化PUFA掺入膜脂质，产生脂质过氧化物（LPO）的各个组分。相比之下，由酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL3）介导的单不饱和脂肪酸活化通过抵消PUFA的作用来防止铁死亡。诱导癌细胞铁死亡已被证明可以逆转晚期癌症治疗的耐药性。

细胞凋亡是最常见和最重要的PCD形式。在氧化应激下，促凋亡蛋白（如Bax和caspase-3）的表达水平显著增加，同时抗凋亡蛋白（如Bcl-2）的水平降低，这进一步加速了细胞凋亡的进程。此外，氧化应激降低线粒体膜电位（MMP），改变线粒体通透性，并促进细胞色素c的释放，从而激活凋亡信号通路。氧化应激过程中产生的大量·OH会导致DNA损伤并抑制PARP活性，导致凋亡。凋亡抵抗是肿瘤细胞的一个标志。触发凋亡或铁死亡是临床癌症治疗中广泛使用的方法。然而，肿瘤细胞经常产生复杂的耐药机制，显著降低这些治疗的有效性。因此，同时诱导凋亡和铁死亡可能绕过NSCLC的这种耐药性。

线粒体是细胞代谢和细胞氧化还原反应的核心部位，对于癌细胞的存活、生长和增殖至关重要。基于临床研究的进展和对线粒体生物学的理解，线粒体已成为许多疾病的有吸引力的治疗靶点。线粒体是体内氧化应激的主要来源。线粒体功能障碍时，线粒体电子传递链（ETC）在线粒体基质和膜中产生超氧阴离子和H₂O₂，这些是更有害ROS的“种子”。线粒体功能障碍是铁死亡的一个显著特征。此外，线粒体途径在内在凋亡中起着至关重要的作用。通过调节线粒体功能来扩大当前使用的抗肿瘤药物的细胞毒性需要进一步分析。

Icariside II（ICS II）是一种天然黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经保护、代谢调节和逆转耐药活性。先前的研究表明，ICS II增强了顺铂的抗癌活性，并促进了NSCLC细胞中的内质网应激。ICS II通过激活线粒体依赖性caspase-9/caspase-3通路抑制宫颈癌发展。此外，ICS II通过上调miR-324-3p来清除肾细胞癌中的细胞GPX4，从而激活铁死亡。这些发现表明ICS II可用于治疗NSCLC；然而，需要进一步研究以确定其潜在机制。

本研究探讨了ICS II诱导铁死亡和凋亡的能力，这与ROS介导的氧化应激相关。ICS II不仅抑制了Nrf2介导的抗氧化反应以促进铁死亡性细胞死亡，而且还通过激活caspase级联和DNA损伤促进了凋亡信号通路。我们的研究阐明了ICS II作用的具体分子机制。我们还利用肿瘤对氧化应激的易感性和多重PCD诱导，为抗NSCLC药物的选择和开发提供了见解。

本研究采用了多种关键技术方法。细胞实验使用人NSCLC A549和H1299细胞系以及人支气管上皮细胞（BEAS-2B）。通过MTT法、克隆形成实验、Edu细胞增殖实验评估细胞活力和增殖。通过伤口愈合实验和Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组学分析，筛选差异表达基因（DEGs）并进行GO和KEGG富集分析。通过流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）和TUNEL染色检测细胞凋亡。通过透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构变化。通过JC-1染色和流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP）。通过化学发光法检测ATP水平。通过MitoSOX Red荧光探针检测线粒体超氧化物水平。通过分子对接预测ICS II与靶蛋白（Nrf2、ACSL4、ACSL3）的相互作用。通过蛋白质印迹（Western blot）和定量实时聚合酶链反应（qPCR）检测相关蛋白和mRNA表达水平。通过小鼠皮下移植瘤模型进行体内药效和安全性评价。通过组织化学染色（HE染色、免疫组织化学）和血液生化指标检测评估组织病理变化和器官功能。

3.1. ICS II剂量依赖性地抑制NSCLC细胞活力、增殖和克隆形成能力

ICS II以剂量依赖性方式抑制NSCLC细胞（A549和H1299）的活力。ICS II处理48小时后，细胞增殖减慢，细胞密度降低，细胞变形甚至脱落。ICS II对正常细胞（BEAS-2B）的毒性低于对NSCLC细胞，表明其毒性对NSCLC细胞具有选择性。EdU荧光和集落形成实验表明，ICS II处理降低了EdU阳性增殖细胞的比例和形成的克隆数量，表明ICS II抑制了细胞的增殖和克隆形成能力。

3.2. ICS II抑制NSCLC细胞的侵袭和迁移

伤口愈合和Transwell实验表明，ICS II显著降低了NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。ICS II上调了上皮标志物E-钙黏蛋白的表达，下调了间质标志物N-钙黏蛋白、波形蛋白以及基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达，表明ICS II阻碍了上皮-间质转化（EMT）和转移。

3.3. RNA测序分析揭示了ICS II在NSCLC中的作用机制

RNA测序分析鉴定了ICS II处理与未处理NSCLC细胞之间的差异表达基因（DEGs）。GO分析显示，DEGs在线粒体和线粒体相关生物过程中富集。KEGG富集分析显示，凋亡和铁死亡通路是可能的作用机制。

3.4. 铁死亡介导ICS II的抗NSCLC作用

ICS II处理导致细胞内Fe²⁺、ROS、MDA和LDH水平升高，而抗氧化分子NADPH/NADP⁺、SOD和GSH水平降低。ICS II下调了铁死亡关键蛋白GPX4、SLC7A11和HO-1的表达。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）预处理可逆转ICS II诱导的细胞活力下降、氧化应激指标改变以及GPX4和SLC7A11表达抑制，证实铁死亡是ICS II诱导NSCLC细胞死亡的主要方式之一。

3.5. ICS II诱导NSCLC细胞线粒体功能障碍

透射电镜显示，ICS II处理导致线粒体收缩、嵴减少、膜密度增高。ICS II降低了细胞内ATP水平，导致线粒体膜电位（MMP）下降，并增加了线粒体超氧化物水平，表明ICS II引起了线粒体功能严重受损。

3.6. ICS II调节Nrf2/HO-1/SLC7A11/GPX4和ACSL4/ACSL3通路

分子对接预测ICS II与Nrf2、ACSL4和ACSL3蛋白具有较强的结合能力。实验证实ICS II降低了核Nrf2和ACSL3的蛋白水平，增加了ACSL4的蛋白水平。Nrf2过表达（Nrf2-OE）可部分逆转ICS II诱导的GSH水平下降、MDA和Fe²⁺水平升高，以及SLC7A11、GPX4和HO-1表达下调，验证了Nrf2/HO-1和Nrf2/SLC7A11/GPX4通路在ICS II诱导铁死亡中的关键作用。

3.7. ICS II诱导NSCLC细胞凋亡

流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）和TUNEL染色显示，ICS II处理显著增加了凋亡细胞比例。Western blot分析表明，ICS II上调促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，表明ICS II激活了凋亡通路。

3.8. ICS II诱导NSCLC氧化应激

ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）与ICS II共处理可显著恢复细胞活力，逆转ICS II对铁死亡相关蛋白（SLC7A11、GPX4、HO-1）表达的抑制，减少TUNEL阳性细胞（凋亡），并缓解线粒体膜电位（MMP）的下降，表明氧化应激是ICS II诱导PCD的核心环节。

3.9. ICS II在体内抑制NSCLC

在小鼠皮下移植瘤模型中，ICS II给药显著抑制了肿瘤生长，且对小鼠体重影响很小，表明其体内抗肿瘤活性良好且毒性较低。肿瘤组织HE染色显示坏死灶形成，Ki67染色表明细胞增殖受到抑制，侵袭迁移相关蛋白表达变化与体外实验一致。

3.10. ICS II在NSCLC皮下肿瘤模型中触发铁死亡且无毒性

体内实验证实，ICS II处理增加了肿瘤组织中的Fe²⁺、ROS、MDA和LDH水平，降低了SOD和GSH水平，导致LPO积累和ATP减少。电镜观察显示肿瘤细胞线粒体形态受损。ICS II下调了肿瘤组织中SLC7A11、GPX4和HO-1的表达，抑制了核Nrf2和ACSL3，上调了ACSL4。TUNEL染色和Western blot证实ICS II也诱导了肿瘤细胞凋亡。重要器官的HE染色和肝肾功能指标检测显示ICS II未引起明显损伤，安全性良好。

本研究证实了ICS II在NSCLC中的抗肿瘤作用及其诱导氧化应激的能力。ICS II通过抑制Nrf2活性和阻碍其核转位，显著下调Nrf2/HO-1和Nrf2/SLC7A11/GPX4介导的抗氧化通路。同时，ICS II改变了ACSL4/ACSL3酶的比例，激活了酶促过氧化反应，导致氧化还原失衡和铁死亡。此外，ICS II诱导的氧化应激不仅破坏了线粒体功能，导致线粒体内容物泄漏和下游caspase级联的激活，而且还抑制了PARP活性并损伤DNA，从而抑制细胞增殖并诱导凋亡。线粒体动力学在ICS II处理的NSCLC细胞中发生改变，可能在ICS II诱导的PCD中发挥重要作用。ICS II在皮下NSCLC肿瘤中显示出治疗潜力，能抑制NSCLC细胞的生长、增殖、侵袭和转移，并且比顺铂具有更好的安全性。

该研究为NSCLC的临床治疗提供了新的候选药物和靶向氧化应激及多重PCD诱导的治疗策略。ICS II通过同时触发铁死亡和凋亡，可能有效克服NSCLC的耐药性问题，具有重要的临床转化前景。未来的研究需要进一步阐明ICS II诱导的铁死亡和凋亡之间的时序关系和交叉对话，以及线粒体动力学调节在其中的具体作用。