臭氧直肠注气通过Nrf2上调抑制TLR4/NF-κB通路减轻COPD模型小鼠肺部炎症

《International Immunopharmacology》：Ozone rectal insufflation attenuates lung inflammation by inhibiting the TLR4/NF-κB pathway through upregulation of Nrf2 in mice with COPD-like pathology

本研究揭示臭氧直肠注气（O3-RI）通过上调核因子E2相关因子2（Nrf2）抑制Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）通路，显著改善慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型小鼠的肺功能、减轻肺部炎症和纤维化，为COPD治疗提供了新策略。

　　

Highlight

臭氧直肠注气通过上调Nrf2抑制TLR4/NF-κB通路，减轻COPD样病理小鼠的肺部炎症

Abstract

炎症是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的一个重要病理特征。臭氧（O₃）是一种由三个氧原子组成的三原子分子，通常被认为是一种具有抗氧化和抗炎特性的氧源性活性气体，被认为是治疗炎症性疾病的有前景的治疗剂，但其对COPD的作用尚不清楚。本研究通过气管内滴注脂多糖（LPS）和弹性蛋白酶建立COPD小鼠模型。臭氧直肠注气（O₃-RI）可以改善肺功能，减少炎症细胞数量，减轻肺组织炎症，降低促炎细胞因子如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-17A（IL-17A）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌。此外，O₃-RI减轻了肺气肿和肺纤维化。对O₃-RI作用机制的进一步探索表明，它上调了核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达，降低了活性氧（ROS）水平，并下调了Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）的表达。研究还表明，Nrf2抑制剂（ML385）消除了O₃-RI诱导的COPD样病理小鼠的抗炎作用，表现为Nrf2表达减少，ROS含量降低，以及TLR4、NF-κB和p-NF-κB表达升高。与单独使用Nrf2激动剂（TBHQ）治疗的COPD样病理小鼠相比，联合使用Nrf2激动剂（TBHQ）和TLR4激动剂（MPLA）并未改变Nrf2的表达，但增加了TLR4、NF-κB和p-NF-κB的表达并加剧了炎症。目前的研究结果表明，O₃-RI对COPD样病理小鼠的保护作用是通过减轻氧化应激和抑制炎症反应来实现的，其具体机制可能与增加Nrf2表达，进而抑制TLR4/NF-κB通路有关。

Introduction

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一个重大的公共卫生问题，是导致慢性呼吸系统疾病发病率和死亡率每年上升的主要原因[[1], [2], [3]]。COPD是一种异质性肺部疾病，以慢性呼吸道症状为特征，是由支气管扩张和细支气管炎等气道异常引起的持续性和进行性气流阻塞[4]。目前，COPD的治疗主要侧重于预防，药物治疗主要包括长效维持性支气管扩张剂和吸入性皮质类固醇。目前的治疗方法改善了一些症状，但未能消除组织炎症，往往效果不尽如人意。因此，迫切需要探索COPD的新治疗策略[5]。

COPD的病理生理过程主要涉及炎症和免疫过程的激活，以及气道和肺实质的重塑。其中，炎症在COPD的发展中起着关键作用[6]。自发现以来，臭氧因其强大的抗炎和抗氧化特性，已被用于治疗包括神经、泌尿生殖、心血管、风湿病和免疫系统在内的各种系统的炎症性疾病[[7], [8], [9], [10]]。先前的研究表明，吸入臭氧会加剧肺部炎症并破坏呼吸屏障[11,12]。然而，最近的研究表明，通过其他途径给予臭氧可能会减轻严重COVID-19对肺组织的有害影响[[13], [14], [15], [16]]。此外，有报道称臭氧通过增强Nrf2的抗氧化活性来保护大鼠免受肺缺血再灌注损伤[17]。还有报道称，臭氧直肠注气可能对肺气肿患者有效[18]。在我们之前的研究中，证实了臭氧直肠注气可减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[19]。目前，主要的临床给药方式是臭氧直肠注气（O₃-RI）和臭氧自体血疗法[20,21]。O₃-RI是非侵入性的，且更容易操作。因此，我们选择O₃-RI作为本研究中的给药方式。

Toll样受体（TLRs）是一类模式识别受体，在免疫应答中发挥重要作用。特别是TLR4，主要识别革兰氏阴性细菌细胞壁成分脂多糖（LPS），从而激活免疫细胞并引发炎症反应。在COPD中，TLR4是先天免疫传感器的主要识别受体之一。值得注意的是，越来越多的证据表明其与支气管炎症密切相关[22]。当TLR4与相应配体结合时，它会激活细胞内信号通路，导致核因子κB（NF-κB）等转录因子的激活，进而促进炎症因子的表达和释放[23]。一项研究表明，臭氧可以降低TLR4、p-IKK等相关因子的蛋白水平，导致NF-κB信号通路失活[24]。

Nrf2是一种关键的转录因子，可保护细胞免受氧化应激损伤并抑制炎症反应。在氧化应激条件下，Nrf2从其特异性受体Keap1上解离并被激活，增强细胞对氧化应激的抵抗力，并在肺部疾病中发挥保护作用[25,26]。氧化应激损伤触发TLR4的激活，随后调节下游NF-κB的激活[27]。有研究表明，臭氧介导的抗氧化作用是通过上调Nrf2和抑制NF-kB来实现的[16,17]。目前尚未有关于O₃-RI治疗由LPS和ELT混合物诱导的COPD的报道。

因此，本研究旨在确定O₃-RI可以减轻COPD样病理小鼠的肺部炎症，从而对COPD产生治疗效果。为了探索其潜在机制，我们进一步验证了这种治疗效果可能是通过上调Nrf2来抑制TLR4/NF-κB通路而发挥的。