脊髓N1电位作为镇痛靶点参与的可转化生物标志物：拉科酰胺、普瑞巴林和塔喷多洛的差异调节作用

《PAIN》：Mindfulness meditation reduces pain more effectively than slow-breathing meditation: the mediating role of respiration

本文推荐一篇关于疼痛研究领域的重要原创研究，该研究通过记录大鼠脊髓背角体感诱发电位（SEP）的N1成分（相当于人类N13），系统评估了三种作用机制不同的镇痛药物（塔喷多洛、拉科酰胺、普瑞巴林）对其的调节作用。结果表明，N1成分能被差异性地调节，这与其各自的镇痛作用机制相符，为跨物种镇痛靶点参与提供了一个概念验证性的可转化生物标志物。

　　

引言

将新型镇痛药成功转化为临床应用的一个重要限制因素是，其在动物疼痛模型中的明显疗效与治疗人类疼痛状况之间存在不匹配。在人体试验之前，行为学观察和来自动物模型的神经记录是评估镇痛效果的主要工具，尽管它们在复制临床状况方面的表面效度有限。引入靶点参与的功能性生物标志物到研究项目中，可能有助于未来的临床成功。此类生物标志物应能够检测伤害性感受系统内的保守通路，从而加强临床前实验的发现。

人类脊髓伤害性感受处理的一个潜在生物标志物是体感诱发电位（SEP）的N13成分。记录于第六颈椎上方与前颈对照，N13代表由正中神经Aβ纤维电刺激触发的脊髓背角神经元活动。N13在实验性疼痛条件下被差异性调节。局部使用辣椒素增加了N13的振幅，而普瑞巴林减弱了这种效应。N13也受条件性疼痛调制减弱，据推测（虽未证实）这可能是通过内源性调节广动力范围（WDR）神经元介导的。这些发现为评估本研究中使用非伤害性刺激诱发的N13来监测伤害性感受过程变化提供了理论依据。可以在麻醉状态下从背角内记录到大鼠等效的N13（命名为N1成分）。然而，啮齿类动物N1的振幅是否受镇痛药调节仍不清楚。

本研究旨在研究标准护理镇痛药如何调节啮齿类动物的N1成分，以评估其作为伤害性感受系统及其调节的功能性生物标志物的潜力。选择这些药物是因为它们具有相似的药代动力学特征以及它们作用于伤害性感受系统的不同部位。

方法

实验按照英国《动物（科学程序）法案1986》进行。所有实验均获得布里斯托大学动物福利和伦理审查委员会的批准。使用雄性Wistar大鼠，在12小时交替的光/暗循环下饲养，自由获取食物和水。

药物在每次实验当天新鲜配制。每只大鼠接受腹腔注射（体积10 mL/kg）拉科酰胺、普瑞巴林或塔喷多洛。塔喷多洛未使用30 mg/kg剂量，因其会导致麻醉大鼠生理状况恶化（呼吸抑制）。按照随机化表示例进行随机分组和盲法实验。

大鼠用异氟烷麻醉。进行椎板切除术暴露脊髓L4-L5节段。使用固定在坐骨神经上的定制双极Ag-AgCl钩状电极进行电刺激。使用64通道硅探针插入腰髓背角记录神经活动。通过轻刷后爪确认探针成功插入接收后爪传入输入的背角节段。

SEP测定方案包括30分钟基线记录和60/90分钟给药后记录。方案包括低强度电刺激和从非伤害性到伤害性范围的斜坡电刺激。在实验终点采集血样用于药代动力学-药效学建模。通过干血斑分析和液相色谱-串联质谱法对药物浓度进行定量。

数据在MATLAB和GraphPad Prism 10中进行分析。从每个电极触点导入数据，低通滤波去除刺激伪影。为每次电刺激提取数据样本并平均以产生平均SEP波形。从SEP的第一个负峰提取N1成分的振幅。通过将刺激点和记录点之间的距离除以N1成分的潜伏期来估计其传导速度。使用混合效应分析和Dunnett多重比较检验计算主要终点（N1振幅相对于基线的百分比变化）和刺激-反应曲线的统计学显著性。使用最小二乘回归模型分析Inn-Nox刺激范式的反应以得出N1的EC50（引起半最大反应的有效电流）。

结果

基线体感诱发电位表征

对每只动物，坐骨神经的低强度电刺激滴定至1.5倍运动阈值。这产生了从插入脊髓背角的64通道多电极探针记录的脊髓SEP。SEP在探针的中部区域达到最大振幅。N1成分的平均振幅为1.33 ± 0.07 mV，平均潜伏期为4.6 ± 0.2 ms。估计激活的外周轴突传导速度为22.2 m/s，与大鼠Aβ初级传入神经元的传导速度一致。

在Inn-Nox刺激后，N1成分的振幅以强度依赖性方式被调节。N1振幅的增加伴随着额外的负成分N2和N3的出现，这分别反映了较高阈值Aδ和C纤维初级传入的强度依赖性募集。N1成分的刺激-反应曲线显示其产生电阈值为0.1 mA，反应的EC50为0.25 mA，峰值振幅在0.8 mA以上达到平台期。

塔喷多洛的作用

使用塔喷多洛评估混合μ-阿片受体激动剂和去甲肾上腺素再摄取抑制剂对N1成分的影响。混合效应分析显示时间、剂量以及剂量×时间交互作用对低强度刺激诱发的N1振幅有显著影响。事后分析显示，与载体相比，10 mg/kg塔喷多洛在注射后10、20、30、40、50和60分钟显著降低了N1成分的振幅。

在10 mg/kg组中，对Inn-Nox方案在基线和给药后60分钟的N1振幅刺激-反应关系进行了探索。混合效应分析揭示了刺激强度的显著影响以及时间×刺激强度的显著交互作用，但时间的主效应不显著。塔喷多洛显著降低了在0.2 mA、0.8 mA、1.6 mA和3.2 mA刺激强度下N1成分的振幅。刺激-反应曲线拟合估计的EC50未被10 mg/kg塔喷多洛显著改变。

塔喷多洛血浆浓度与低强度诱发N1振幅在60分钟时的量效关系曲线显示，在血浆浓度接近微摩尔范围时产生效应。

拉科酰胺的作用

使用拉科酰胺评估N1成分对作用于钠通道的抗神经病理性疼痛药物的敏感性。混合效应分析显示时间以及时间与剂量的交互作用对低强度N1 SEP的振幅有显著影响，但剂量的独立影响不显著。与载体相比，30 mg/kg拉科酰胺在注射后40、50和60分钟降低了低强度诱发N1成分的振幅。

对Inn-Nox刺激后60分钟N1成分振幅的双因素方差分析显示，刺激强度对峰值振幅有显著影响，但拉科酰胺或强度-时间交互作用无显著影响。然而，在30 mg/kg组中，60分钟时刺激-反应曲线出现右移，伴随EC50显著增加。

拉科酰胺血浆浓度与N1振幅在60分钟时的量效关系曲线显示，仅在血浆浓度大于100 μM时反应被调节。

普瑞巴林的作用

使用普瑞巴林评估N1成分对作用于钙通道的抗神经病理性疼痛药物的敏感性。混合效应分析未揭示时间、剂量或时间×剂量交互作用对低强度诱发N1成分振幅有显著影响。

Inn-Nox刺激后，混合效应分析揭示了刺激强度的显著影响，但普瑞巴林剂量或强度×剂量交互作用对N1成分振幅无显著影响。30 mg/kg普瑞巴林在90分钟时未显著调节Inn-Nox刺激后N1成分的EC50。

由普瑞巴林血浆浓度生成的量效关系曲线显示，N1成分在任何浓度下（直至100 μM范围）均未被该药物调节。

讨论

这项临床前电生理学研究显示，在健康麻醉大鼠中，塔喷多洛和拉科酰胺均降低了低强度电刺激诱发的N1成分振幅，并对Inn-Nox刺激诱发的N1成分表现出差异性调节。塔喷多洛在Inn-Nox刺激强度范围内降低了N1振幅，而拉科酰胺导致反应EC50增加，但不影响较高刺激强度诱发的峰值振幅。相比之下，普瑞巴林在本测定中不影响任何刺激诱发的N1 SEP振幅。这些结果表明，N1 SEP被这些临床相关疼痛药物以反映其独特作用机制的方式差异性调节，并提示N1成分可能代表药物研发中一个可行的临床前模型。

N1 SEP的振幅被用来评估外周和脊髓神经元的诱发激活，作为镇痛与伤害性感受系统相互作用的替代指标。N1成分被认为是由皮肤Aβ初级传入刺激后脊髓中间神经元的同步激活产生的。使用多电极硅探针，本研究复制了先前使用单电极表征SEP负成分的位置、振幅和潜伏期的研究。记录部位的荧光染色将N1成分的最大值定位到脊髓背角的IV/V层。在伤害性电刺激后，在N1成分的相同深度观察到诱发的N2和N3成分，其潜伏期与Aδ传入和C伤害性感受器的传导速度一致。这些较长的潜伏期SEP成分反映了伤害性感受系统不同传入对较高刺激强度的分级募集。

塔喷多洛通过两种不同机制发挥镇痛作用：μ-阿片受体激活和去甲肾上腺素转运体再摄取抑制。本研究中，塔喷多洛（10 mg/kg i.p）显著降低了低强度刺激后N1成分的振幅，这在递增的Inn-Nox斜坡电刺激中也观察到。N1成分振幅的降低表明塔喷多洛抑制了Aβ介导的脊髓背角活动，且作用跨越非伤害性到伤害性强度范围。塔喷多洛显著降低了Inn-Nox刺激后的N1 SEP，但未显著影响EC50。这表明塔喷多洛并非通过降低Aβ初级传入神经元的兴奋性来调节N1 SEP，而是通过突触后机制起作用。

电压门控钠通道（VGSCs）决定初级传入神经元的兴奋性和动作电位 initiation，是镇痛药物开发的主要靶点。作为非选择性VGSC阻滞剂，拉科酰胺通过延长VGSCs的失活状态来降低初级传入神经元的兴奋性。本研究中，这反映为N1 SEP的EC50增加，而最大振幅在高刺激强度下未降低。这种模式表明拉科酰胺增加了传入激活的阈值，与对外周初级传入兴奋性的作用一致。

最后，普瑞巴林对N1电位振幅没有显示任何影响，尽管先前有报道称其可预防人类辣椒素诱导的N13调制的发生。药物的血浆浓度超过了普瑞巴林在大鼠神经损伤模型中抗神经病理性疼痛作用的EC50值，表明在30 mg/kg剂量下有足够的暴露。普瑞巴林被认为通过脊髓背角电压门控钙通道（VGCCs）的α₂δ亚基起作用，减少谷氨酸的突触前释放。因此，在致敏模型（急性或慢性）中，普瑞巴林与背根神经节VGCC α₂δ亚基的相互作用被增强，从而增加其对脊髓背角神经元活动的影响，而在初始模型中未观察到这种现象。

本研究的设计存在一些固有的局限性。为获得脊髓背角的高保真度、多位点记录，大鼠必须被麻醉，这限制了向清醒状态的外推能力，并影响了神经元回路兴奋性。尚未在致敏状态下进行研究，这限制了对可能显示如普瑞巴林等药物作用的疼痛状态的普适性。实验设计利用了重复测量观察允许进行动物内比较，增加了统计效力，但对于这项多剂量药物的基础性研究，每组使用了保守的动物数量，这使我们能够解析所测试药物的中度到大效应量，但不能排除可能未解析出较小效应。也未包括对背角内不同细胞类别的详细分析。

本研究的结果共同为使用N1 SEP评估新型镇痛药的靶点参与奠定了基础，将其作为背角伤害性感受处理的相关指标。下一步将是更好地定义在N1 SEP产生过程中脊髓中被激活的功能性神经元群体，这将进一步指导其应用于测试新型镇痛化合物。类似地，在致敏疼痛模型中探索其调节作用和实用性，对于支持其转化作用非常重要，特别是在可以最好地复制人类疼痛状况的方面。