利用纳米内窥镜-原子力显微镜（Nanoendoscopy-AFM）通过直接压痕法探究纳米力学，揭示了癌细胞中的核弹性转变

《ACS Applied Nano Materials》：Probing Nanomechanics by Direct Indentation Using Nanoendoscopy-AFM Reveals the Nuclear Elasticity Transition in Cancer Cells

纳米探针力显微镜（NE-AFM）技术首次在活细胞中定量分析血清剥夺和TGF-β诱导的EMT对核弹性的动态影响，发现核弹性与H4K20me3水平正相关，而非核膜蛋白表达。

　　### 研究背景与意义

在癌症研究中，细胞核的机械特性，尤其是其弹性，被认为是一种重要的生物标志物。细胞核的弹性不仅与细胞的结构稳定性相关，还可能影响基因表达、细胞分裂以及细胞迁移等关键生物学过程。然而，目前对细胞核弹性进行精确测量仍面临诸多挑战。传统的测量方法通常依赖于细胞膜的压痕技术或使用微吸管对分离的细胞核进行测量，但这些方法存在一定的局限性。例如，细胞膜压痕法会受到细胞膜和细胞骨架的影响，难以准确反映细胞核本身的机械特性；而对分离细胞核的测量则无法体现其在完整细胞中的状态。因此，开发一种能够直接测量完整细胞核弹性的新技术成为当前研究的重点。

本研究中，我们引入了一种名为“纳米内窥镜原子力显微镜（Nanoendoscopy-AFM, NE-AFM）”的新技术。该技术通过将纳米探针插入活细胞中，直接测量细胞核的弹性并绘制其分布图。相比传统方法，NE-AFM能够避免细胞膜和细胞骨架的干扰，从而更准确地反映细胞核的机械特性。此外，NE-AFM还能够进行高精度、高分辨率的测量，为研究细胞核弹性与癌症进展之间的关系提供了新的工具。

### NE-AFM技术的原理与优势

NE-AFM技术的核心在于纳米探针的设计与应用。纳米探针的长度为5 μm，直径控制在160 nm以下，以确保其在细胞内的插入不会对细胞造成严重损伤。探针的尖端经过电子束沉积（EBD）处理，使其具有较高的机械稳定性和可控的插入深度。在实验过程中，纳米探针被插入到细胞内部，并在多个点上进行力-距离（F-z）曲线的测量。通过这些曲线，可以区分细胞膜和细胞核的接触点，并进一步计算出它们的弹性模量。

为了提高测量的准确性，我们优化了探针的插入条件，并开发了专门的分析软件。该软件能够从大量的力-距离曲线中筛选出那些能够清晰反映细胞核接触点的曲线，从而减少其他细胞结构（如细胞骨架、囊泡等）对测量结果的干扰。此外，我们还验证了探针插入过程中底部效应的最小化，确保测量结果不受细胞培养基的影响。

### 实验设计与结果分析

我们首先使用NE-AFM技术对正常培养条件下的细胞核弹性进行了测量，并与细胞膜弹性进行了对比。结果显示，细胞膜的弹性模量约为2942 ± 863 Pa，而细胞核的弹性模量约为3373 ± 474 Pa，表明细胞核比细胞膜更坚硬。随后，我们研究了不同培养条件对细胞核弹性的影响，包括血清存在与否以及TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）。

在血清缺乏的条件下，细胞核的弹性显著增加。这可能是由于血清缺乏导致细胞周期停滞，从而促进了异染色质的浓缩。异染色质的浓缩会增强细胞核的硬度，因此在血清缺乏的情况下，细胞核表现出更高的弹性。然而，当血清缺乏的细胞被TGF-β处理后，细胞核的弹性又显著降低。TGF-β是一种已知的EMT诱导因子，能够促进细胞迁移和侵袭能力。我们的结果表明，TGF-β处理后，细胞核的弹性下降，这可能与异染色质的解浓缩和染色质结构的松弛有关。

值得注意的是，在比较正常细胞（PC9）和脑转移细胞（PC9-BrM）时，我们发现两者的细胞核弹性变化趋势并不一致。尽管脑转移细胞在某些情况下表现出更低的弹性，但在其他条件下却与正常细胞相似。这一现象可能与细胞在转移过程中经历的动态变化有关。例如，脑转移细胞可能在转移过程中暂时经历了EMT，但随后在培养过程中逐渐恢复了其原有的机械特性。因此，我们得出结论，细胞核的弹性变化可能不仅仅由EMT直接决定，还受到其他因素的影响。

### 染色质结构与细胞核弹性的关系

在本研究中，我们还探讨了细胞核弹性变化是否与染色质结构的变化相关。染色质可以分为异染色质（紧密包装）和常染色质（松散包装），它们的结构状态对细胞核的机械特性具有重要影响。异染色质通常与基因沉默相关，而常染色质则与基因活跃性相关。我们发现，细胞核弹性与异染色质的三甲基化水平（特别是组蛋白H4在赖氨酸20位的三甲基化，H4K20me3）呈正相关，而不是与核纤层蛋白的表达水平相关。

这一发现表明，细胞核的弹性变化可能主要由染色质结构的改变所驱动。H4K20me3是一种与异染色质形成密切相关的组蛋白修饰，其水平的增加会导致染色质更加紧密，从而增强细胞核的硬度。相反，当H4K20me3水平下降时，染色质变得更加松散，细胞核的弹性也随之降低。因此，细胞核的弹性变化可以作为染色质状态变化的潜在生物标志物。

### 与细胞膜弹性的对比

除了研究细胞核弹性变化外，我们还比较了细胞膜弹性在不同条件下的变化。结果显示，在血清缺乏的条件下，细胞膜的弹性显著增加，而在TGF-β处理后，细胞膜的弹性则保持不变。这一现象可能与细胞膜的组成和结构变化有关，但需要进一步研究以确定其具体机制。

此外，我们还发现，脑转移细胞（PC9-BrM）在血清存在的情况下表现出较低的细胞膜弹性，而在血清缺乏时弹性显著增加。这一结果可能与细胞膜在不同培养条件下的适应性变化有关，同时也提示我们，细胞膜弹性可能受到血清浓度的影响，而不仅仅是细胞核弹性。

### 研究的生物学意义

本研究的结果不仅有助于理解细胞核弹性在癌症进展中的作用，还为癌症的早期诊断和治疗提供了新的思路。细胞核的弹性变化可能与癌细胞的侵袭性和转移能力相关，因此，通过测量细胞核弹性，可以更准确地评估癌细胞的恶性程度。此外，细胞核弹性变化还可能与染色质结构的变化密切相关，因此，研究细胞核弹性可以为探索染色质动态调控机制提供重要线索。

### 未来研究方向

尽管本研究取得了重要进展，但仍有许多问题需要进一步探讨。例如，不同类型的癌细胞在血清缺乏或TGF-β处理下的细胞核弹性变化是否具有普遍性？是否所有癌细胞都表现出类似的弹性变化模式？此外，细胞核弹性变化的具体机制是什么？是染色质结构的改变，还是核纤层蛋白的表达水平变化？这些问题需要通过更多的实验和研究来解答。

另一个重要的研究方向是探索NE-AFM技术在其他细胞结构中的应用。目前，我们已经成功应用于细胞核的弹性测量，但该技术是否能够用于测量其他细胞器的机械特性，如线粒体膜或细胞骨架的弹性？如果能够实现，那么NE-AFM将成为一种强有力的工具，用于研究细胞内部的机械特性及其在疾病发生中的作用。

### 结论与展望

综上所述，本研究通过NE-AFM技术成功测量了活细胞中细胞核的弹性，并揭示了其在血清缺乏和TGF-β诱导下的变化规律。我们发现，细胞核弹性与异染色质的三甲基化水平密切相关，而非核纤层蛋白的表达水平。这一结果为理解细胞核弹性变化的分子机制提供了新的视角，并为癌症的诊断和治疗提供了潜在的生物标志物。

未来，我们计划进一步优化NE-AFM技术，使其能够在更广泛的细胞类型和实验条件下应用。同时，我们也将探索细胞核弹性变化与其他细胞机械特性的关系，以全面了解细胞机械特性在癌症进展中的作用。此外，我们还将研究细胞核弹性变化在其他疾病中的潜在应用，如神经退行性疾病或免疫相关疾病。通过这些研究，我们希望能够为细胞机械特性的深入理解以及相关疾病的治疗提供新的理论基础和技术支持。