NK1受体拮抗剂CP-99994对小鼠术后面部痛苦表情及触觉痛觉过敏疗效评估：与已知镇痛药的比较研究

《PAIN》：Evaluating the efficacy of neurokinin-1 (substance P) receptor antagonist CP-99994 on facial grimacing and allodynia in mice postsurgery: a comparative study with known analgesics

本研究通过开发机器学习算法（MLA）自动化评估白化CD-1小鼠腹腔镜术后面部痛苦表情（MGS），系统比较了神经激肽-1（P物质）受体（NK1R）拮抗剂CP-99994与镇痛药卡洛芬（Carprofen）和丁丙诺啡（Buprenorphine）的疗效。结果显示，卡洛芬和丁丙诺啡能显著降低平均MGS评分和高痛苦表情帧比例，而CP-99994仅在最高剂量（30 mg/kg）时短期起效。主成分分析（PCA）进一步证实CP-99994对自发疼痛指标（面部表情）效果有限，但可减轻机械性触觉痛觉过敏（allodynia）。研究提示，结合自发疼痛评估与传统伤害性反应测试可能更准确预测药物镇痛潜力，降低转化失败风险。

　　

引言

神经肽P物质及其受体神经激肽-1受体（NK1R或TACR1）长期以来被认为参与伤害性信号传导。在受到伤害性刺激后，P物质从肽能背根神经节神经元释放，导致NK1R神经元去极化，并增强脊髓背角的谷氨酸能神经传递。通过拮抗剂阻断该受体或消融NK1R脊髓神经元可减轻热痛觉过敏和机械性触觉痛觉过敏——这两种诱发的伤害性反应指标。这些临床前研究支持了NK1R拮抗剂的临床推进。然而，包括CP-99994在内的NK1R拮抗剂在六项不同的临床试验中显示出微弱或无镇痛活性，而非甾体抗炎药（NSAIDs）在试验中确实减轻了疼痛。这些临床失败引发了对这一有前景的药物类别为何在临床前研究中具有抗伤害作用，却在人类中缺乏镇痛特性的质疑。

有推测认为，过度依赖诱发的伤害性反应可能会导致转化失败，尤其是在将临床前候选药物（包括NK1R拮抗剂）推进到临床试验时。事实上，过去40年中发表的大多数临床前研究使用诱发的伤害性指标来量化急性和慢性疼痛的严重程度。然而，这些诱发测试并不能充分衡量自发疼痛——这是患有各种形式疼痛（包括术后疼痛、炎性疼痛和神经病理性疼痛）的人报告的主要症状。

面部痛苦表情被用于量化人类、啮齿类动物和其他哺乳动物的自发疼痛。少数镇痛药通过手动和自动评分方法被发现有减轻面部痛苦表情的作用。然而，目前尚不清楚那些在临床前研究中能减少诱发伤害性反应，但随后作为镇痛药失败的药物是否能减轻啮齿类动物的面部痛苦表情。本研究旨在评估一种经过充分研究的NK1R拮抗剂（CP-99994）在腹腔镜手术后（一种术后疼痛模型）对远交系CD-1小鼠面部痛苦表情的影响程度。这种白化小鼠品系常用于疼痛研究，因此我们还开发了一种机器学习算法（MLA），使用PainFace软件平台对白化小鼠的面部痛苦表情进行评分。PainFace是我们的实验室开发的一种深度神经网络和基于云的软件平台软件，用于自动化面部表情分析。

方法

动物护理与使用

本研究中的所有程序均获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会的批准。群养的雄性和雌性CD-1小鼠（查尔斯河实验室，8-12周龄）自由进食，并保持在12:12小时的光暗周期下。

功效分析

功效分析表明，假设效应量为中等（f = 0.2），α错误概率为0.05，每个治疗组需要16只小鼠。我们将初始组大小增加到30只，因为根据我们之前的实验，我们预计一些视频或动物需要被排除，因为小鼠并不总是面向摄像头（导致可用于准确评分面部表情的图像数量不足），或者在实验终点之前达到了安乐死终点。

成像设置

成像室连接到一个ThorLabs面包板上。小鼠用环境顶灯照明（成像室内约1500勒克斯）。使用树莓派4相机录制H.264视频，在上传到PainFace之前转换为MP4文件。

腹腔镜手术

腹腔镜手术按照先前描述的方法进行。简而言之，小鼠在早晨被适应测试室环境30分钟，然后转移到成像室。录制30帧/秒的基线视频（30分钟）。接着，用5%异氟烷麻醉小鼠直至后爪反射消失，并在手术期间暴露于1.75%异氟烷。使用人工泪液润滑眼睛。腹部喷洒乙醇，然后在臀部和肋骨之间剃毛。用聚维酮碘和氯己定清洁该区域三次。然后喷洒乙醇去除聚维酮碘和氯己定，并用70%乙醇冲洗。在腹部中央、臀部正上方做一个1.5厘米的横向皮肤切口。做一个1至1.5厘米的腹膜切口以进入肠道。用镊子触诊约1至2厘米的肠道10秒钟。缝合腹膜和腹腔。外层切口用组织粘合剂封闭。每只小鼠的手术在6到8分钟内完成。将小鼠放在加热垫上30分钟。恢复期后，将小鼠放入成像室，录制30分钟的视频。然后在稍后的时间点录制更多视频。

修改后的腹腔镜手术便于在切口部位测量机械性触觉痛觉过敏。在做好1厘米的腹膜切口后，用一对钝头镊子挤压切口周围的皮肤。接着，将无菌棉签插入腹腔并在腔内移动30秒。如上所述关闭切口。每只小鼠的手术在8到10分钟内完成。

实验1：各种药物对腹腔镜手术后面部痛苦表情的影响

小鼠在手术前立即皮下注射0.9%无菌盐水或药物。卡洛芬以5、25或50 mg/kg的剂量给药。卡洛芬曾用于人类治疗疼痛，但因不良反应在1980年代被撤回。丁丙诺啡以0.01、0.05或0.1 mg/kg的剂量给药。CP-99994以3、10或30 mg/kg的剂量给药，这些剂量在小鼠和/或其他啮齿类动物皮下注射时具有抗伤害作用。所有药物均用0.9%盐水稀释，并随机给药，所有药物平行测试，以避免批次效应。在术后30分钟、2小时、4小时和24小时录制视频（持续30分钟）。

实验2：各种药物对腹腔镜手术后切口部位机械性触觉痛觉过敏的影响

CD-1小鼠在实验开始前适应von Frey设置1周。在适应期间，将0.4克von Frey细丝应用于即将做切口的腹壁附近（每天5次，持续3天）。在第0天，记录基线机械敏感性评分。简而言之，用0.4克细丝刺激切口区域5次。每次刺激保持细丝3秒钟。“0”分表示无反应，“1”分表示舔舐或腹部移动，“2”分表示畏缩，“3”分表示小鼠跳跃或在腔内移动。将5个分数相加得到敏感性评分。基线敏感性评分高于6的小鼠被从研究中移除。在第1天，对每只动物进行修改后的腹腔镜手术。手术后四小时，收集每只动物的另一个机械敏感性评分。在第2天，给小鼠注射盐水、卡洛芬（50 mg/kg）、丁丙诺啡（0.1 mg/kg）或CP-99994（30 mg/kg）。在图表所示的时间点（注射后30分钟和180分钟）收集机械敏感性评分。

用于量化白化小鼠面部痛苦表情的机器学习算法

我们开发、训练和测试了一种MLA，使用PainFace软件平台量化白化小鼠的面部痛苦表情。我们生成了使用白化小鼠痛苦表情量表评分的真实训练数据。对于该量表，五个面部动作单元（眶周收紧、鼻子隆起、耳朵位置、胡须变化、脸颊隆起）被分配0（不存在）、1（中度）或2（明显）的分数。我们从142只CD-1雄性小鼠在基线条件下和腹腔镜手术后处于行为成像室中时收集了高清彩色视频。将这些视频上传到PainFace，专家手动在每个FAU周围绘制边界框，并为每个FAU分配MGS分数。总共评分了63,493张图像。这些真实图像随后被分为训练组和测试组，两组之间没有重叠图像。使用我们先前研究中描述的相同MLA架构为每个FAU输出0、1或2的分数以及置信度值。我们将这些个体分数相加，为每只动物的每个视频帧生成一个MGS分数。我们还为白化小鼠重新训练了面部检测模型，类似于我们训练黑鼠面部检测模型的方式。我们使用白鼠注释数据对模型进行微调，得到了所示的性能结果。每个动作单元的F分数为0.67至0.84，与我们黑鼠痛苦表情MLA模型的F分数一致。我们使用混淆矩阵来显示完全训练模型的分类准确性和精确度。

PainFace痛苦表情分析

视频上传到PainFace并以1 fps进行评估。确定每个视频前10分钟和整个30分钟内的可用帧百分比。只有PainFace检测到所有5个FAU的帧才被认为是可用的——这个指标表明小鼠面向摄像头。可用5 FAU帧少于12.5%的视频被排除在分析之外。然后我们随机采样5 FAU帧，计算平均MGS分数，以及MGS分数≥5（高痛苦表情）和≤2（低痛苦表情）的帧百分比。还开发了一个PainFace后分析模块，为最终用户自动化这些数据采样和随机化步骤。

主成分分析

该分析使用来自盐水处理和最高药物剂量小鼠的数据进行。在用于实验的小鼠中，那些在术后30分钟、2小时和4小时录制的30分钟视频中每个视频至少有12.5%可用帧的小鼠被用于此分析。其中，16只盐水组、14只卡洛芬组、20只丁丙诺啡组和10只CP-99994组小鼠符合这些标准。分析视频的前10分钟，14只盐水组、16只卡洛芬组、21只丁丙诺啡组和13只CP-99994组小鼠符合这些标准。在每个时间点，收集它们的平均痛苦表情分数。我们使用在每个时间点随机采样的平均MGS分数进行了PCA。将前两个成分相互绘制可以在二维图中比较不同变量，同时仍然解释组间的大部分方差。使用RStudio中的K均值聚类算法检测在PCA空间中注射盐水和药物的个体小鼠之间分离的准确性。

PainFace软件用户界面

PainFace界面为用户提供了许多选项。可以上传视频，并附加元数据，包括性别、物种和其他实验信息。上传后，可以根据所需数据的广度以三种不同的采样率分析视频。默认MLA是最新版本，但可以选择较早的版本来允许用户使用旧版本分析数据。可以批量分析多个视频。分析完成后，可以选择下载包含分析信息的.csv或.zip文件，也可以选择在PainFace中打开数据集检查数据。还有一个选项可以量化来自一个或多个输出.csv分析文件的平均痛苦表情、具有低和高MGS分数的帧百分比以及可用帧百分比。

结果

白鼠面部痛苦表情算法的验证

小鼠在腹腔镜手术后 reliably 出现痛苦表情，兽用镇痛药卡洛芬能减轻这种术后疼痛模型中的面部痛苦表情。为了验证PainFace白鼠面部痛苦表情算法并评估镇痛效果，我们收集了雄性CD-1小鼠手术前的基线视频，然后将动物随机分为10个治疗组。在腹腔镜手术后30分钟、2小时、4小时和24小时收集额外的30分钟视频。使用PainFace以1 fps分析面部痛苦表情。为了进一步验证MLA，我们手动评分了来自每组（盐水、卡洛芬、丁丙诺啡和CP-99994）的6个视频中随机采样的10帧，这些视频已由PainFace评分。手动评分和PainFace评分之间未检测到显著差异，与我们之前使用黑化小鼠的研究一致。首先关注NSAID镇痛药卡洛芬，我们从前10分钟随机采样了75个包含所有5个FAU的帧，并从整个30分钟视频中随机采样了225个帧。我们检测到50 mg/kg卡洛芬治疗组在术后长达4小时内，相对于盐水处理的动物，平均MGS分数显著降低。最低剂量的卡洛芬（5 mg/kg）在分析每个视频的前10分钟时，在术后长达4小时内也显著降低了平均MGS分数；在分析整个30分钟视频时，效果持续到2小时。

接受两种最高剂量阿片类镇痛药丁丙诺啡（0.05和0.1 mg/kg）的小鼠，在分析前10分钟时，术后长达4小时内平均MGS分数显著降低，但在24小时时没有。当分析每个视频的整个30分钟时，这些差异仍然存在。这些数据验证了PainFace在检测白化CD1小鼠面部痛苦表情和镇痛药介导的痛苦表情缓解方面的效用。

同时，我们在手术前立即给予NK1R拮抗剂CP-99994，并在术后24小时内收集视频。在分析每个视频的前10分钟时，在任何时间点均未观察到相对于盐水处理的对照组的变化。然而，在术后2小时，当分析整个视频时，30 mg/kg剂量显示平均MGS分数相对于盐水对照组显著降低。这些数据表明，与卡洛芬和丁丙诺啡相比，CP-99994在缓解小鼠面部痛苦表情方面效果有限。

我们还绘制了每个治疗组中5 FAU帧的百分比。可用帧的百分比随时间略有下降，24小时时间点的5 FAU帧百分比最低。我们推测重复暴露于腔室可能导致习惯化，使得小鼠更可能面向侧面或后面，这些位置会妨碍面部检测。在任何时间或任何条件下，检测到的5 FAU帧百分比与盐水处理的动物相比没有显著差异，只有一个例外：当分析完整的30分钟视频时，在0.1 mg/kg丁丙诺啡处理的动物中，2小时时间点的5 FAU帧百分比显著增加。

镇痛药减少高痛苦表情帧的百分比

我们还评估了平均MGS分数≥5的5 FAU帧的百分比，我们将其操作性地定义为“高痛苦表情”帧。预计镇痛药会减少高痛苦表情帧的数量相对于盐水处理的对照组。确实，在腹腔镜手术后的几个时间点，卡洛芬的5 mg/kg和50 mg/kg剂量显著降低了高痛苦表情帧的百分比。丁丙诺啡在0.05 mg/kg和0.1 mg/kg剂量下，在术后几个时间点相对于盐水处理的对照组也显著降低了高痛苦表情帧的百分比。然后我们检查了CP-99994处理组中高痛苦表情帧的百分比。与平均MGS分数分析一致，仅在最高30 mg/kg剂量下，在2小时时间点高痛苦表情帧的百分比有显著降低。

个体面部动作单元分数分析

我们接下来比较了腹腔镜手术后每个个体FAU的分数与其各自的基线值。与各自的基线相比，每个FAU分数在术后均有显著增加，表明白化小鼠中每个FAU都对总MGS分数有贡献。

用于评估个体动物随时间变化的面部痛苦表情的主成分分析

我们随时间量化了同一只动物的面部痛苦表情，使得可以对这时序数据进行PCA分析。PCA用于将大量变量组合成更少的称为主成分的独立变量，这些变量解释两组之间的方差。此外，k均值聚类可用于评估将个体动物分配到已知治疗组的准确性。对于PCA，我们使用了来自盐水处理的小鼠和接受每种药物最高剂量（卡洛芬、丁丙诺啡和CP-99994）的小鼠在每个时间点的平均MGS分数。碎石图分析表明PC1占数据变异的67%至79%。PC1值可以作为每只动物的“严重程度”分数。该分析使我们能够通过降维整合到一个分数中，来检查每种药物治疗在多个时间点的有效性。还为每个条件生成了PC1分数的箱线图。与盐水条件相比，卡洛芬和丁丙诺啡的最高剂量在PC1值上存在显著差异。然而，CP-99994的最高剂量与盐水在PC1分数上没有差异。我们还绘制了每种药物的k均值聚类结果。我们发现，使用前10分钟的数据，个体小鼠可以以86.7%的准确率被分配到正确的组；使用30分钟视频的数据，准确率为83.1%。类似地，个体小鼠被分配到正确组的准确率，对于前10分钟为74.3%，对于整个视频为80.6%。当比较盐水与CP-99994处理的小鼠时，分配准确率较低，前10分钟为70.4%，整个30分钟视频为73.1%。PCA表明，腹腔镜术后药物处理的小鼠被准确分配到正确的治疗组，尽管药物效果并未在所有时间点持续，这提供了一种更灵敏的方法来确定治疗效果。

雌性CD-1小鼠面部痛苦表情的药物疗效

我们接下来对雌性小鼠进行了腹腔镜手术，并施用了用于雄性CD-1小鼠的每种药物的最高剂量。雌性小鼠也在基线、术后30分钟、2小时、4小时和24小时被记录。CP-99994同样在每个时间点都无效于减轻面部痛苦表情，而丁丙诺啡显著减轻了面部痛苦表情。卡洛芬在雌性小鼠腹腔镜手术后并未减轻面部痛苦表情，与上述雄性数据形成对比。我们还比较了每个时间点雄性和雌性之间的MGS分数。我们观察到的最一致的差异是，在术后30分钟、2小时和4小时，丁丙诺啡处理对雌性小鼠面部痛苦表情的减轻程度大于雄性小鼠。

丁丙诺啡和CP-99994减轻切口部位的触觉痛觉过敏

最后，我们试图评估上述药物减轻触觉痛觉过敏（一种诱发的伤害性指标）的程度。我们没有像上面那样触诊肠道，而是使用无菌棉签刺激腹部切口部位，这会导致皮肤敏感和切口部位的触觉痛觉过敏。使用这种修改后的程序，我们发现与假手术小鼠相比，面部痛苦表情在术后24小时内保持升高。然后我们用0.4克von Frey细丝刺激切口部位以计算敏感性评分。我们比较了盐水处理的腹腔镜手术小鼠与假手术动物。正如预期的那样，接受腹腔镜手术的小鼠对机械刺激更敏感，触觉痛觉过敏持续72小时。在腹腔镜手术后24小时，我们用50 mg/kg卡洛芬、0.1 mg/kg丁丙诺啡或30 mg/kg CP-99994处理小鼠。我们在注射后30分钟和180分钟测量机械敏感性。与注射盐水的小鼠相比，丁丙诺啡和CP-99994都显著减轻了机械性触觉痛觉过敏。卡洛芬没有显著减轻触觉痛觉过敏。这些数据表明，在使用诱发的伤害性指标时，丁丙诺啡和CP-99994能有效减轻机械性触觉痛觉过敏。

讨论

对NK1拮抗剂、TACR1基因敲除小鼠和使用P物质-皂草毒素结合物消融NK1R脊髓神经元的研究表明，在炎症期间具有抗伤害作用，而对急性伤害性反应影响极小。这些和其他临床前研究支持NK1R拮抗剂作为镇痛药的开发和推进。尽管当时备受关注，但NK1R拮抗剂在至少六项不同的临床试验中测试时，基本上无法减轻疼痛。只有一项牙科手术后的研究观察到轻微的疼痛缓解。药物在临床研究中失败的原因有很多，例如未达到安全性终点，或使用了错误的剂量或临床终点。NK1R拮抗剂在临床中失败的潜在原因已被广泛评述。

支持NK1R拮抗剂临床推进的临床前研究是在小鼠痛苦表情量表开发之前完成的。因此，我们试图评估一种NK1R拮抗剂在腹腔镜手术后减轻小鼠面部痛苦表情的程度。腹腔镜手术通常用于探查性手术、肿瘤切除、肠梗阻解除、器官切除或移植以及治疗其他医疗问题。我们测试了两种已知的镇痛药，阿片类丁丙诺啡和NSAID卡洛芬作为阳性对照。为了促进这些研究，我们还开发了一种MLA来对白化小鼠的面部痛苦表情进行评分。该模型扩展了PainFace软件平台的实用性，使研究人员能够对黑化和白化小鼠视频中的面部痛苦表情进行评分。

睡眠是评分面部痛苦表情时一个已知的混淆因素，可能使检测面部痛苦表情的轻微减少变得更加困难。例如，镇痛药部分通过使小鼠睁开眯着的眼睛来减轻面部痛苦表情。我们注意到一些动物在成像室中待的时间越长，开始入睡，这可能导致随着时间的推移平均MGS分数升高，因为眼睛开始闭合。因此，为了最大化我们检测镇痛药对面部痛苦表情轻微影响的机会，我们分析了每个视频的前10分钟以及整个30分钟。最近一项研究在不同的术后疼痛模型中评估了四个时间点的面部痛苦表情，没有发现时间差异。

我们发现，减轻面部痛苦表情的药物（卡洛芬、丁丙诺啡）能持续有效地起作用，并且不止在一个剂量下有效，而CP-99994仅在减轻面部痛苦表情方面效果有限。无论痛苦表情数据如何分析，都观察到边际效果。PCA分析整合了个体动物多个时间点的痛苦表情数据，表明两种已知的镇痛药能有效减轻面部痛苦表情，而CP-99994无效。然而，丁丙诺啡和CP-99994都减轻了机械性触觉痛觉过敏。这些发现揭示了CP-99994对诱发疼痛指标和自发疼痛指标的影响存在分离。面部痛苦表情提供了一种评估非语言动物持续疼痛的方法，无需直接刺激损伤部位。尽管需要进一步的研究，例如使用额外的NK1R拮抗剂以及那些在人类中未能缓解疼痛的药物，但我们的研究表明，过度依赖诱发的伤害性测定可能提供不完整的镇痛潜力评估，并增加转化失败的风险。未来的临床试验可能会受益于使用多种分析方法来评估疼痛。例如，使用面部痛苦表情来研究啮齿类动物的自发疼痛，结合使用传统的行为测试，可能更好地预测哪些药物具有最大的镇痛潜力。其他人也 similarly 寻求在评估候选镇痛药时扩大行为测试的范围。

我们关注CP-99994是因为这种拮抗剂在临床前研究中被广泛使用，使我们能够选择已知在体内具有抗伤害作用的途径、载体和剂量。此外，CP-99994曾在人类中进行过测试。使用口腔手术模型，将CP-99994的有效性与常用的NSAID布洛芬进行了比较。在第一项使用视觉模拟量表的研究中，布洛芬在缓解疼痛方面比CP-99994更有效。CP-99994在前90分钟有轻微的镇痛作用，而布洛芬与安慰剂相比，能缓解术后疼痛240分钟。在第二项试验中，CP-99994在长达120分钟内有效降低VAS，而布洛芬的镇痛作用持续到240分钟。CP-99994的这种微弱疼痛缓解与我们研究的结果一致，即CP-99994在2小时时间点和最高剂量下对面部痛苦表情有显著影响，而两种已知的镇痛药更有效。

我们还发现了雄性和雌性CD-1小鼠之间的差异。值得注意的是，卡洛芬在雌性小鼠腹腔镜手术后并未减轻面部痛苦表情，而相同剂量在雄性中有效。我们的结果与McKenna等人的研究一致，其中雌性CD-1小鼠接受了卵巢切除术，并接受了5 mg/kg或10 mg/kg的卡洛芬。在评估了几种行为后，包括闭眼和触觉痛觉过敏，卡洛芬在减轻雌性小鼠的疼痛反应方面无效。此外，我们发现丁丙诺啡在减轻雌性CD-1小鼠腹腔镜手术后的面部痛苦表情方面比雄性更有效。我们的结果表明，在为CD-1小鼠选择镇痛药时需要考虑性别。我们应该强调，我们的研究重点是远交系CD-1小鼠。鉴于越来越多的研究表明雄性和雌性的行为可能因品系背景而异，需要进一步的研究来确定这些性别差异是否存在于其他品系以及其他手术模型中。

最后，我们的研究验证了我们新的白鼠面部痛苦表情模型的使用。平均MGS分数在分析面部痛苦表情时通常被报告，主要是因为从少量手动评分的帧中计算这个值是实用的。PainFace的自动化、高采样率使得可以以其他方式分析面部痛苦表情数据，例如MGS分数≥5的帧百分比。这些“高痛苦表情”帧只能通过自动化方法合理测量，其中每个视频评估数百帧，允许对结果数据进行随机采样。并且与使用PCA分析行为数据的其他研究一致，我们发现多维分析可用于计算个体动物的疼痛“严重程度”分数，并检测盐水和药物处理动物之间的显著差异。多维分析不必局限于面部痛苦表情数据，未来可以扩展到可以从上传到PainFace的视频中评分的其他自发行为。