不依赖于领导结构的C-末端修饰通过一种自由基S-腺苷酰-L-甲硫氨酸成熟酶实现，从而生成大环结构的GLP-1类似肽

《ACS Bio & Med Chem Au》：Leader-Independent C-Terminal Modification by a Radical S-Adenosyl-l-methionine Maturase Enables Macrocyclic GLP-1-Like Peptides

硫醚交联酶PapB无需N端领序列即可催化肽链硫醚交联，并成功将三种GLP-1受体激动剂衍生物转化为C端环状结构，为开发无领序列依赖的肽环化生物催化技术提供新证据。

　　这项研究揭示了PapB这种由放射性S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）介导的肽成熟酶在催化过程中对N端引导序列的高度不依赖性。传统的RiPP（核糖体合成并翻译后修饰的肽）成熟机制通常依赖于N端引导序列与成熟酶中的RRE（RiPP识别元件）之间的相互作用，以确保底物的正确识别和修饰。然而，PapB的催化能力显示出显著的扩展性，能够有效处理缺乏典型引导序列的底物，这为RiPP成熟酶的生物催化应用提供了新的可能性。

PapB是一种已知能够引入硫（硒）醚交联的成熟酶，其作用机制基于一种特殊的化学反应路径。该酶能够识别特定的Cys-Xn-Asp/Glu序列，并通过其活性中心进行交联反应。在本研究中，科学家们通过一系列实验发现，即使去除了PapB的RRE结构域，该酶仍然能够催化底物的交联反应。这一发现挑战了以往认为RRE结构域是催化必需的假设，并表明PapB具有更广泛的底物适应能力。

在实验中，研究人员使用了三种具有治疗价值的肽类似物：semaglutide、tirzepatide和retatrutide，它们分别是GLP-1（胰高血糖素样肽-1）受体激动剂，用于治疗肥胖和糖尿病。这些肽通常含有多个非天然氨基酸，如Aib（α-氨基异丁酸）和α-Me-Leu（α-甲基亮氨酸），这些氨基酸在药物设计中被用来提高药效和药代动力学特性。通过在这些肽的C端添加CSANDA序列，研究人员成功地利用PapB将它们转化为硫醚环化结构。实验结果显示，PapB能够高效地将这些非典型底物转化为稳定的环状结构，且转化效率接近完全。

这一发现的意义在于，PapB不仅能够处理传统意义上的RiPP底物，还能够催化多种结构复杂的肽进行环化。这种灵活性使得PapB成为一种强大的生物催化剂，能够在后期阶段对多种肽进行结构修饰。传统化学方法在肽环化方面存在诸多限制，例如成本高、结构复杂性难以控制、对天然氨基酸的兼容性差等。相比之下，PapB的催化过程更为高效和精准，能够在单一反应步骤中实现多点交联，生成结构复杂的环状肽。此外，由于PapB不需要依赖引导序列，因此可以避免在肽合成过程中引入额外的序列，从而简化整个合成流程。

PapB的这种特性对于药物开发具有重要意义。环状肽相较于线性肽具有更高的结构稳定性，能够抵抗体内蛋白酶的降解，延长药物的半衰期。同时，环状结构可以改变肽的构象，使其更倾向于与特定的受体结合，从而增强其生物活性。例如，在研究中提到的semaglutide类似物，通过PapB的催化作用形成了一个稳定的硫醚环化结构，这可能有助于提高其对GLP-1受体的结合能力，进而增强其降血糖效果。类似地，tirzepatide和retatrutide的环化产物也表现出类似的特性，说明PapB的催化能力具有广泛的适用性。

此外，研究人员还探讨了PapB催化过程的机理。通过分析PapB及其RRE缺失突变体的结构，发现其活性中心与传统RiPP成熟酶存在相似之处，但其催化能力似乎并不完全依赖于RRE结构域。这表明，PapB的催化机制可能涉及其他区域，或者其与底物的相互作用模式不同于其他RiPP成熟酶。进一步的实验表明，即使在缺乏引导序列的情况下，PapB仍然能够识别并修饰底物中的特定序列，这可能与其活性中心的结构和功能特性有关。

值得注意的是，PapB的催化能力并不局限于特定的底物类型。在实验中，研究人员测试了多种不同的底物，包括含有同型半胱氨酸和Asp/Glu的肽，结果表明PapB仍然能够有效地进行交联反应。这表明，PapB对底物的识别和修饰具有一定的通用性，能够适应多种不同的氨基酸组合。这一特性对于设计新型药物分子尤为重要，因为许多具有治疗潜力的肽可能包含非天然氨基酸，而传统方法难以处理这些复杂的结构。

为了验证PapB的催化能力，研究人员进行了多组实验，包括质量分析、碰撞诱导解离（CID）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。实验结果表明，PapB能够高效地将底物转化为环状结构，并且该转化过程在多种条件下均能稳定进行。例如，在没有引导序列的情况下，PapB仍然能够催化msPapA（一种简化版的PapA底物）形成硫醚交联产物，这进一步支持了其催化能力的广泛性。

在实际应用中，PapB的这种特性为药物开发提供了新的思路。传统方法通常需要在肽的N端添加引导序列，以便于成熟酶的识别和修饰。然而，这种方法可能会增加肽的长度和复杂性，影响其生物活性和药代动力学特性。相比之下，PapB能够在不依赖引导序列的情况下直接催化C端的交联反应，这为设计更简洁、更高效的药物分子提供了可能。此外，PapB的催化过程可以在体外精确控制，避免了体内环境中的干扰因素，从而提高了实验的可重复性和可控性。

研究人员还讨论了PapB催化反应的可能机制。虽然RRE结构域通常被认为是RiPP成熟酶识别底物的关键部分，但实验结果表明，PapB的催化能力并不完全依赖于这一结构域。这可能意味着，PapB的活性中心能够独立识别底物中的特定序列，而无需依赖引导序列。这种机制的发现对于理解RiPP成熟酶的催化机制具有重要意义，并可能为其他类似酶的开发提供理论依据。

PapB的这种催化能力也引发了对RiPP成熟酶普遍机制的重新思考。传统的RiPP成熟酶通常需要引导序列来确保其正确识别和修饰底物，但PapB的实验结果表明，这种依赖性并非绝对。这一发现可能意味着，某些RiPP成熟酶具有更广泛的底物适应性，或者其催化机制存在不同的调控方式。因此，未来的研究可能会进一步探索其他RiPP成熟酶是否也具有类似的特性，以及这些特性在不同生物系统中的表现。

在实验过程中，研究人员还采用了多种分析技术，包括液相色谱-质谱联用（LC-MS）、碰撞诱导解离（CID）和质量分析。这些技术能够提供详细的分子信息，帮助研究人员确认交联反应是否成功，并进一步分析产物的结构特征。例如，通过LC-MS分析，研究人员能够观察到底物在PapB作用下发生的质量变化，从而判断其是否形成了硫醚交联。而CID分析则能够提供更详细的碎片信息，帮助研究人员确定交联的具体位置。

此外，实验中还涉及了多种化学修饰步骤，例如使用碘乙酸胺（IAM）进行烷基化处理，以确认交联反应是否发生。在处理过程中，研究人员发现，经过PapB催化后的肽样品对IAM的反应性降低，这表明其Cys残基已经被交联，从而减少了与IAM的反应。这一结果进一步验证了PapB的催化效果，并提供了有力的证据支持其在非引导序列底物上的活性。

总的来说，这项研究不仅揭示了PapB在催化过程中的独特特性，还为RiPP成熟酶的应用提供了新的视角。PapB的这种能力使得其成为一种理想的生物催化剂，能够用于多种肽的后期环化修饰。这种技术的推广可能会对药物开发产生深远影响，尤其是在设计具有稳定结构和高效生物活性的新型肽药物方面。通过利用PapB的催化能力，研究人员可以更灵活地调整肽的结构，从而优化其药效和药代动力学特性。此外，这一发现也为理解RiPP成熟酶的普遍机制提供了新的线索，可能推动更多相关研究的开展。