用于抗原特异性T细胞激活的树突状细胞膜包覆纳米粒子的开发

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Development of Dendritic Cell Membrane-Coated Nanoparticles for Antigen-Specific T-Cell Engagement

树突状细胞膜包覆纳米颗粒（DCmPs）通过优化包覆工艺（超声、挤压及联合方法）可提升粒径均匀性及蛋白质包覆效率，且DCmPs能特异性结合抗原识别的CD8+ T细胞并激活其增殖。

　　膜包裹纳米颗粒（DCmPs）作为抗原特异性治疗的一种新型工具，其在免疫治疗领域展现出广阔的应用前景。DCmPs能够携带关键的树突状细胞（DC）膜蛋白，如主要组织相容性复合体（MHC）、共刺激分子CD80/CD86以及粘附分子ICAM-1，这些蛋白在DC与T细胞的相互作用中起着至关重要的作用。然而，目前对DCmPs的制备过程和最终产物组成的影响理解仍较为有限，这在一定程度上限制了其在治疗中的进一步开发。本文通过使用DC2.4细胞膜蛋白和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒，系统地比较了三种不同的膜包裹方法：超声波处理、挤出法以及一种新的组合处理方法（先超声波处理后挤出）。研究结果表明，组合处理方法不仅实现了较高的膜蛋白包裹率，还对DCmPs的直径和均匀性具有更精细的控制能力，这在治疗应用中尤为重要。

### 1. 背景介绍

膜包裹纳米颗粒（CNPs）作为一种具有细胞模拟功能的纳米材料，已经被广泛应用于药物递送、癌症免疫治疗、抗炎和疫苗等领域。这些纳米颗粒通常由合成纳米核心和细胞膜包裹组成。多种纳米核心材料，如PLGA纳米颗粒、金纳米颗粒和介孔二氧化硅纳米颗粒，已经被用于药物封装。细胞膜包裹为CNPs提供了多种膜蛋白，从而赋予其类似来源细胞的功能。例如，红细胞膜包裹的纳米颗粒因其缺乏免疫识别能力而具有较长的体内循环时间；肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒能够优先在原发肿瘤组织中聚集，有助于靶向药物输送或组织成像；而巨噬细胞或中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒可以通过膜结合的细胞因子受体和粘附分子与循环肿瘤细胞相互作用。此外，通过基因编辑、脂质插入或膜融合等方式，可以扩展CNPs的功能性，使其超越来源细胞固有的能力，提高其治疗效果和灵活性。

近年来，DC膜包裹纳米颗粒（DCmPs）引起了越来越多的研究关注。DCs通过加工和呈递抗原启动适应性免疫反应，这一过程依赖于多种DC膜蛋白，包括pMHC与T细胞受体（TCRs）的相互作用、CD80/CD86作为共刺激分子与T细胞的结合，以及ICAM-1与LFA-1的粘附分子相互作用。DCmPs能够保留这些关键膜蛋白，从而激活抗原特异性T细胞，为疫苗和免疫治疗提供新的策略。然而，关于DCmPs的蛋白覆盖程度和纯度的详细分析仍然不足，这可能会影响对治疗效果的解读，并对未来的开发构成挑战。

### 2. 材料与方法

#### 2.1 细胞培养

DC2.4细胞系（Merck，cat. no. SCC142）在含有10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素-链霉素（P/S）、1× L-谷氨酰胺、1× MEM NEAA、1× HEPES（25 mM）和0.0054× β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中培养。B3Z细胞由James Moon博士赠予，DOBW细胞由Clifford Harding博士赠予。所有细胞均在含有5% CO?的37°C恒温培养箱中培养。

#### 2.2 骨髓树突状细胞（BMDC）分化

从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，经过红细胞裂解、洗涤和过滤后获得单细胞悬液。细胞以2×10?个/mL的密度接种于6孔板中，并在含有10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、50 μM β-巯基乙醇和1× P/S的RPMI 1640培养基中培养。第3天，将60%的培养基替换为含有Flt3配体（200 ng/mL）的新鲜培养基。第7天，通过温和吹打收集未成熟BMDC用于后续实验。

#### 2.3 佐剂刺激和细胞毒性

DC2.4细胞在含有不同浓度的佐剂（如LPS、Poly(I/C)和干扰素-γ）和卵白蛋白（OVA）的情况下进行刺激。刺激过程在96孔板中进行，每个孔含2×10?个细胞和200 μL的相应处理条件。细胞毒性通过MTS细胞增殖测定法评估，具体步骤包括加入20 μL的检测试剂，37°C下孵育1–4小时，然后使用96孔板读数仪测量490 nm处的吸光度。细胞存活率计算为百分比。

#### 2.4 DC2.4细胞膜蛋白分离

DC2.4细胞通过细胞刮刀收集，并在1× Tris缓冲液中洗涤和重悬。随后，细胞在含有EDTA和蛋白酶抑制剂的1× Tris缓冲液中进行膜蛋白分离。细胞通过Dounce匀浆器进行机械破坏，并在3000g下离心10分钟，重复此过程后，将上清液进行超速离心（100,000g，60分钟，4°C）以获得细胞膜蛋白。最终的膜蛋白悬浮液用1× PBS和0.05% Tween-20重悬，并通过Bradford或BCA法测定蛋白浓度，保存于-80°C。通过该方法，每1亿个DC2.4细胞可回收约1.5 mg的膜蛋白。

#### 2.5 DC膜包裹纳米颗粒（DCmPs）的制备与表征

PLGA纳米颗粒通过纳米沉淀法制备，将1 mg/mL PLGA（Polysciences，cat. no. 23986-5）的乙腈溶液滴加到含有1%聚乙烯醇（PVA）的10 mL水溶液中，快速搅拌（600 rpm）后，搅拌速度降至200 rpm，使有机溶剂在室温下缓慢蒸发。如需荧光标记，则在1% PVA溶液中加入0.005% w/v的罗丹明B（RhoB）后开始沉淀过程。次日，纳米颗粒用去离子水和Centricon 100 kDa滤膜（Millipore，cat. no. UFC910024）洗涤五次，离心后收集用于膜包裹。

#### 2.6 流式细胞术分析DC2.4细胞表面标记物

细胞首先用LIVE/DEAD Fixable Dye（FVD）染色20分钟，随后用荧光标记的抗体（如MHC-I、MHC-II、CD80、CD86和ICAM-1）进行表面蛋白染色。所有细胞在2.4G2抗体（Fc阻断）存在下进行染色，染色后用含1% FBS的流动缓冲液洗涤两次，并用4%多聚甲醛固定10分钟。DCmP颗粒在洗涤过程中同样用10,000g离心10分钟去除未结合的蛋白。最终样本用BD LSR Fortessa流式细胞仪分析，结果用FlowJo软件（版本10.10）进行处理。

#### 2.7 动态光散射（DLS）测量

使用Zetasizer仪器进行DLS测量，通过ZS Xplorer软件操作。样品浓度为1 mg/mL或根据需要稀释。使用DTS0012或DTS1070比色皿进行测量，以确定平均粒径分布和Zeta电位。实验参数包括单次测量、25°C测量温度和120秒的平衡时间。

#### 2.8 透射电子显微镜（TEM）成像

样品在≥10 mg/mL的浓度下制备，并在1× PBS中进行滴加。将4 μL样品滴加在碳涂层的TEM网格上，30秒后在15 mA下进行沉积。样品在5分钟后吸附，然后用滤纸去除多余液体。网格用UltraPure去离子水洗涤两次，每次1–2分钟。随后，用1%醋酸铀进行染色1分钟，去除多余染色剂后，让网格在滤纸上干燥几分钟，最后放入网格盒中并在真空干燥器中保存至成像。成像使用JEOL JEM-1400 TEM在80 kV下进行，图像通过Gatan Orius SC1000 CCD相机获取，并使用ImageJ软件进行处理和分析。

#### 2.9 SDS–PAGE和Western blotting

蛋白样品通过将所需蛋白与2×样品缓冲液（Novex，cat. no. LC2676）按1:1体积比混合制备。样品在75°C下加热5分钟，并加载至4–12% Tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen，cat. no. XP04120BOX）中，使用1×运行缓冲液（Invitrogen，cat. no. NP0001）。同时加载5 μL的蛋白梯度（Thermo Scientific，cat. no. 26619）后进行电泳。电泳结束后，凝胶用Blue Stain（Thermo Scientific，cat. no. 24590）染色1小时。

对于Western blotting分析，为获得足够的蛋白进行Western blotting，进行了多轮膜包裹。收集的DCmPs（通过超声波、挤出或组合方法）进行浓缩，以获得合适的体积进行SDS–PAGE加载。凝胶转移到0.45 μm硝化纤维膜上，使用75 V和75分钟进行转移。膜用5%脱脂乳在TBST（TBS含0.05% Tween-20）中阻断1小时。膜随后与初级抗体（如MHC-I、MHC-II、CD80、CD86和ICAM-1）在2%脱脂乳的TBST中孵育2小时或过夜。膜用TBST洗涤4–5次后，与次级抗体（HRP-标记抗体）在5%脱脂乳的TBST中孵育1小时。再洗涤4–5次后，使用ChemiDoc MP成像系统进行蛋白检测。使用Fiji（ImageJ）软件对Western blot蛋白条带进行定量分析，将条带强度归一化到Na?/K?-ATPase，并计算相对于适当对照的倍数变化。

#### 2.10 免疫细胞与DCmPs的相互作用

为进行流式细胞术分析，将2×10?个DC2.4、B3Z或DOBW细胞接种于96孔板中，并与每种NP制剂以最终浓度100 μg/mL（基于PLGA重量）共培养4小时。细胞用冷流动缓冲液洗涤三次，并用FVD染色10分钟，随后用4%多聚甲醛固定。使用BD LSRFortessa分析仪进行流式细胞术分析。

为进行共聚焦显微镜分析，将2×10?个DC2.4细胞接种于无菌4孔室式载玻片（SPL，cat. no. 30104），并用相应NP制剂以最终浓度100 μg/mL（基于PLGA重量）处理4小时。细胞用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）轻轻洗涤两次以去除未结合的NP，随后用4%多聚甲醛固定10分钟。细胞用DAPI（Thermo Scientific，cat. no. 202710100）染色以可视化细胞核。载玻片用Permount Mounting Media（Fisher Chemical，cat. no. SP15-100）固定。使用Leica Dmi8共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行成像。通过Fiji（ImageJ）软件使用Manders系数进行共定位分析：M1表示RhoB标记的PLGA NP与CFSE标记的膜蛋白的重叠比例，而M2表示CFSE标记的膜蛋白与RhoB标记的PLGA NP的重叠比例。通过将Manders系数乘以100，以百分比形式表达共定位。使用四张独立图像进行分析。

#### 2.11 DOBW细胞激活实验

将2×10?个DOBW细胞接种于96孔板中，并与100 μg/mL的DCmP或非刺激DCmP共培养3天，或与OVA/LPS刺激的DC2.4细胞或BMDC以1:1比例共培养。作为阴性对照，2×10?个DOBW细胞单独培养或与未刺激的DC2.4细胞或BMDC共培养。所有培养均在37°C和5% CO?下进行。培养结束后，使用ELISA试剂盒（Invitrogen，cat. no. BMS601）检测培养基中的IL-2浓度。

#### 2.12 B3Z细胞激活实验

将2×10?个B3Z细胞接种于96孔板中，并与100 μg/mL的DCmP或非刺激DCmP共培养2天，或与OVA/LPS刺激的DC2.4细胞或BMDC以1:1比例共培养。共培养结束后，将培养基替换为含0.15 mM CPRG（氯酚红-β-D-半乳糖苷）、0.1% Triton X-100、9 mM MgCl?和100 μM β-巯基乙醇的PBS溶液。细胞在37°C黑暗条件下孵育90分钟。使用微孔板读数仪（Synergy/H1，BioTek）测定570 nm处的吸光度。

#### 2.13 统计分析

使用GraphPad Prism版本10.4.2进行数据分析。两组之间的统计比较使用未配对的Student’s t检验，而三组或更多组之间的比较使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey多重比较检验。

### 3. 结果

#### 3.1 刺激的DC2.4细胞膜蛋白表征

DCs通过抗原呈递启动适应性免疫反应，并激活T细胞。这一过程依赖于多种DC膜蛋白，包括pMHC与T细胞受体（TCRs）的相互作用、CD80/CD86作为共刺激分子与T细胞的结合，以及ICAM-1作为粘附分子促进DC-T细胞免疫突触的形成。为了最大化DC2.4细胞的膜蛋白表达，我们比较了几种常见的刺激条件，包括LPS（TLR-4激动剂）、Poly(I/C)（TLR-3激动剂）和IFNγ（DC激活细胞因子）。

在OVA蛋白抗原和LPS的刺激下，我们使用流式细胞术检测了DC2.4细胞的膜蛋白水平。结果表明，LPS在测试浓度范围内促进了MHC-I和CD80的高表达，而IFNγ刺激则导致ICAM-1和CD86的最高表达。所有刺激条件均表现出较低的细胞毒性。考虑到LPS在较低浓度下即可实现膜蛋白的高表达，且其他佐剂的成本较高，我们决定在后续研究中重点研究LPS和OVA刺激的DC2.4细胞的膜蛋白表达。

此外，尽管LPS促进了MHC-II的表达，但整体MHC-II蛋白表达水平仍然较低，这与其他研究结果一致。我们进一步通过SDS–PAGE和Western blot分析了LPS刺激和非刺激DC2.4细胞的蛋白表达概况和呈递相关膜蛋白水平。SDS–PAGE结果显示，刺激的DC2.4细胞表现出更复杂和增强的蛋白条带模式，表明LPS处理后膜蛋白表达增强。Western blot分析进一步确认了LPS刺激的DC2.4细胞中所有检测的呈递相关膜蛋白表达水平均高于非刺激细胞。然而，流式细胞术和Western blotting检测到的ICAM-1水平变化可能存在差异，这可能是由于两种技术固有的不同所致。流式细胞术检测的是ICAM-1的天然形式，而Western blot检测的是变性蛋白。抗体敏感性的差异也可能导致这种不一致。蛋白表达的倍数变化通过归一化到膜蛋白对照（Na?/K?-ATPase）进行量化，并显示LPS刺激显著提高了DC2.4细胞中MHC-I、CD80、CD86和ICAM-1的表达水平。这些结果确认了LPS刺激能够有效促进DC2.4细胞呈递相关膜蛋白的表达，从而可能有利于后续的膜蛋白提取和NP包裹。

#### 3.2 DCmPs的制备与物理表征

为了制备膜包裹颗粒，我们首先通过匀浆和超速离心分离了LPS刺激的DC2.4细胞的膜蛋白。通过SDS–PAGE确认了每一步的蛋白提取（图S5）。PLGA纳米颗粒通过纳米沉淀法制备，平均直径为100 nm（图2B）。为了制备DCmPs，我们采用了两种传统包裹方法：超声波和挤出。此外，我们还开发了一种新的组合方法，即在超声波处理后进行挤出（图2A）。我们假设，这种组合方法可以在不降低膜蛋白包裹量的前提下提高颗粒直径的均匀性。通过比较三种方法制备的包裹颗粒的直径和Zeta电位，我们发现，三种方法的平均直径分别为340 nm（超声波）、350 nm（挤出）和180 nm（组合方法），均大于未包裹的PLGA纳米颗粒（100 nm）。直径的增加表明颗粒表面存在蛋白包裹。通过DLS测定，我们发现超声波和挤出方法制备的DCmPs的多分散性指数（PDI）均高于未包裹的纳米颗粒（图2D）。组合方法中的额外挤出步骤显著降低了尺寸分布，表明该方法能够提高颗粒的均匀性和可重复性。值得注意的是，在去除未结合蛋白的离心过程中，最终产物出现了聚集现象，导致颗粒直径和PDI在离心前较低（图S6）。所有DCmP组的Zeta电位均低于未包裹的PLGA纳米颗粒，这也表明存在蛋白包裹，这与之前的研究结果一致（图2E）。通过TEM确认了膜包裹的存在，所有三种方法制备的DCmPs均在颗粒表面显示出明显的膜层（图2F）。这些结果证实了成功将刺激的DC2.4细胞膜包裹到PLGA纳米颗粒上。在三种包裹策略中，组合方法（超声波后挤出）制备的DCmPs直径最小且尺寸分布最均匀，表明该方法在控制膜包裹纳米颗粒尺寸方面具有优势。尽管组合方法制备的颗粒直径最小，但其蛋白包裹量（10.9%的喂养蛋白）仍略高于仅挤出方法（约5.5%的喂养蛋白），而超声波方法则达到了最高的蛋白包裹量（15.2%的喂养蛋白）。这些结果表明，组合方法在三种方法中表现出对DCmPs尺寸的最佳控制，并且在蛋白包裹量方面优于挤出方法。通过组合方法制备的DCmPs的较小直径和较窄尺寸分布可能对未来的体内应用具有更好的生物分布优势。值得注意的是，虽然TEM成像确认了膜包裹的存在，但由于采样限制，我们无法通过TEM量化尺寸分布。未来可能需要使用冷冻电镜（cryo-EM）来准确表征颗粒形态和尺寸分布。

#### 3.3 DCmPs的蛋白表征

在确认蛋白包裹存在后，我们使用Bradford法测定蛋白含量，并计算蛋白包裹效率。在1:1的PLGA纳米颗粒与膜蛋白比例下，通过超声波制备的DCmPs包裹了约15%的总喂养蛋白，而组合方法制备的DCmPs包裹了约11%的总喂养蛋白（图3A）。相比之下，仅挤出方法的蛋白包裹效率显著低于超声波方法，仅达到了约5%的总喂养蛋白。这种低包裹效率进一步通过发现挤出样品的上清液中未结合蛋白的含量显著高于超声波样品的上清液来确认（图S7）。随后，我们通过SDS–PAGE和Western blot分析了DCmPs的蛋白组成。SDS–PAGE结果显示，三种方法制备的DCmPs的蛋白图谱均与分离的DC2.4细胞膜蛋白相似，表明所有三种方法都能保留膜蛋白的整体组成（图3B）。SDS–PAGE分析的上清液（在离心后去除未结合蛋白）显示出不同的蛋白图谱，其中蛋白条带主要缺失，仅保留分子量在70至130 kDa之间的蛋白，表明膜蛋白包裹在DCmPs上是成功且无偏见的（图3B）。通过Western blot分析，我们成功检测到了DCmPs上存在关键的呈递相关膜蛋白，包括MHC-I、共刺激分子（CD86和CD80）和粘附分子（ICAM-1）（图3C）。然而，Western blot分析未能明确不同包裹方法对单个蛋白包裹的影响（图3C和S8）。总体而言，所有三种包裹方法均能保留膜蛋白的整体组成，并且超声波和组合方法在蛋白包裹效率方面优于挤出方法。

#### 3.4 DCmPs的组成表征

为了进一步深入了解三种包裹方法制备的DCmPs的组成差异，我们利用DC2.4细胞与膜包裹颗粒之间的同源相互作用，使用DC2.4细胞作为检测工具，以避免流式细胞术和共聚焦成像的分辨率限制（图4）。通过将RhoB标记的PLGA纳米颗粒与CFSE标记的DC2.4细胞膜蛋白组合制备DCmPs，我们发现，在与DCmPs共培养4小时后，约77–80%的DC2.4细胞同时内部化了PLGA核心和膜蛋白（图4A、D）。我们得出结论，这种双阳性群体很可能是因为DCmPs的内部化，而不是因为混合了PLGA纳米颗粒和膜蛋白。此外，约12–14%的DC2.4细胞内部化了PLGA纳米颗粒，而4–9%的细胞仅内部化了膜蛋白，表明存在未结合的蛋白和未包裹的颗粒（图4B、C）。通过共聚焦显微镜分析，我们确认了约60–79%的RhoB标记的PLGA纳米颗粒与CFSE标记的膜蛋白共定位，表明大部分PLGA纳米颗粒在最终产物中被膜蛋白包裹（图4E、F）。此外，约50%的CFSE标记的蛋白在所有三种包裹方法的样品中未结合（图4E、G）。流式细胞术和共聚焦显微镜测定的DCmP组成存在显著差异，这可能是由于共聚焦显微镜的采样偏差或其对细胞内蛋白的更详细观察所致。此外，细胞内的荧光斑点表明DCmPs可能通过内吞作用进入DC2.4细胞。我们还观察到细胞膜周围的CFSE信号，这可能表明DCmPs在细胞膜上沉积。然而，确定DCmPs的具体内吞途径仍需进一步研究。尽管如此，我们的研究提供了一种新的策略来确定膜包裹颗粒的组成。所有三种包裹方法均显示约80%的PLGA颗粒被膜蛋白包裹，而最终产物中仍含有大量未结合的蛋白和少量未包裹的颗粒。

#### 3.5 DCmPs对T细胞的抗原特异性结合

在确认了DCmPs上存在关键的呈递相关膜蛋白后，我们进一步研究这些膜蛋白是否能够促进DCmPs与T细胞的结合。我们使用OVA蛋白作为模型抗原，并确定了一种能够显著上调这些关键蛋白的LPS刺激条件。我们通过流式细胞术确认了这些蛋白在DCmPs上的存在（图1、3和S1）。尽管超声波和组合方法表现出更高的整体蛋白包裹量，但Western blot分析未能明确不同包裹方法对单个蛋白包裹的影响（图3C和S8）。进一步研究仍需解决这一问题。然而，我们确认LPS刺激对于提高DCmPs上的关键表面蛋白包裹量至关重要，这与使用BMDC膜蛋白的另一项研究结果一致。

通过流式细胞术，我们发现DCmPs上SIINFEKL/MHC-I、总体MHC-I、CD86和ICAM-1的表达水平显著高于非刺激DCmPs（图5）。因此，使用佐剂刺激的DCs可以提高DCmPs上关键蛋白的包裹量，但包裹方法对单个蛋白包裹的影响并不显著。值得注意的是，DC2.4细胞在激活B3Z细胞方面比DCmPs更有效，这可能是由于DCs能够调整细胞形态以更好地与受体结合。此外，仍需进一步研究以确定我们的DCmP剂量是否与DC2.4细胞在实验中的呈递能力相当。未来的研究需要对DCmPs中蛋白活性进行分子水平的量化，以便在体外和体内实验中直接比较其呈递能力。

#### 3.6 DCmPs对T细胞的激活

通过流式细胞术，我们发现B3Z细胞在与荧光标记的DCmPs共培养4小时后，约15%的细胞内部化了DCmPs，而仅1%的DOBW细胞为双阳性（图6B、E、H）。非刺激DCmPs未显示出对这两种细胞的结合（图6B、E、H）。这些数据表明，DCmPs与B3Z细胞的结合是由pMHC-I与TCRs的特异性相互作用介导的。此外，DCmP处理的B3Z细胞产生了β-半乳糖苷酶，这表明DCmPs能够呈递SIINFEKL抗原并激活B3Z细胞（图6J）。非刺激DCmPs也显示出可检测的但较弱的B3Z激活，这可能是由于非刺激DC2.4细胞本身具有一定的呈递能力（图5B和S14）。因此，DC2.4细胞可能具有激活B3Z细胞的内在能力，这可能有助于非刺激DCmPs的激活效果。

此外，我们观察到约60%的B3Z细胞仅表现出RhoB信号，这可能表明它们结合了未包裹的PLGA纳米颗粒（图6C）。而约30%的DOBW细胞也仅表现出RhoB信号（图6F、I）。这一现象与未结合的PLGA纳米颗粒或非刺激DCmPs对B3Z细胞或DOBW细胞的结合结果不符。由于混合蛋白质和纳米颗粒并未提高PLGA纳米颗粒的细胞结合率（图S11），我们推测观察到的RhoB阳性群体是由于PLGA纳米颗粒携带了少量的DC膜蛋白。这些膜蛋白可能介导颗粒与细胞的相互作用，但其数量可能低于流式细胞术的检测阈值。辅助分子如CD86和ICAM-1可能在颗粒与DOBW细胞的非抗原特异性结合中起作用。然而，验证这一假设需要对DCmPs进行高分辨率的表征，这超出了本研究的范围。未来的研究还需进一步阐明辅助分子在T细胞结合中的作用。尽管如此，我们的数据清楚地表明，DCmPs在体外能够特异性结合抗原特异性T细胞，并通过抗原呈递激活T细胞。

### 4. 讨论

膜包裹纳米颗粒（CNPs）在模拟细胞界面方面表现出色，因为它们能够携带来源细胞的膜蛋白，从而赋予其类似来源细胞的功能。DC膜包裹纳米颗粒（DCmPs）特别能够携带许多重要的DC膜蛋白，包括MHC、共刺激分子（CD80/CD86）和粘附分子（ICAM-1），这些蛋白使DCmPs能够与T细胞相互作用并激活它们，为抗原特异性治疗提供新的策略。然而，DCmPs的制备过程和最终产物组成的影响仍然缺乏深入研究，这限制了其在治疗中的进一步开发。为了填补这一知识空白，我们使用DC2.4细胞膜蛋白和PLGA纳米颗粒比较了三种不同的包裹方法：超声波处理、挤出法和组合方法（先超声波处理后挤出）。研究结果表明，组合方法在控制颗粒尺寸方面表现最佳，并且在蛋白包裹量上优于挤出法。通过使用DC2.4细胞作为检测工具，我们确认了所有三种包裹方法在PLGA纳米颗粒上的蛋白包裹水平相似，而最终产物中仍含有未结合的蛋白和少量未包裹的颗粒。通过Western blot和流式细胞术分析，我们证实了DCmPs上存在呈递相关蛋白，并且LPS刺激显著提高了这些蛋白的包裹量。最终，DCmPs能够特异性结合抗原特异性T细胞，并通过抗原呈递激活T细胞。这些发现为膜包裹颗粒的开发建立了一种新的包裹策略和表征方法，并展示了DCmP技术在抗原特异性治疗中的潜力。

此外，通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析，我们发现约60%的B3Z细胞仅表现出RhoB信号，这可能表明它们结合了未包裹的PLGA纳米颗粒。而约30%的DOBW细胞也仅表现出RhoB信号（图6C、F、I）。这一现象与未结合的PLGA纳米颗粒或非刺激DCmPs对B3Z细胞或DOBW细胞的结合结果不符。由于混合蛋白质和纳米颗粒并未提高PLGA纳米颗粒的细胞结合率（图S11），我们推测观察到的RhoB阳性群体是由于PLGA纳米颗粒携带了少量的DC膜蛋白。这些膜蛋白可能介导颗粒与细胞的相互作用，但其数量可能低于流式细胞术的检测阈值。辅助分子如CD86和ICAM-1可能在颗粒与DOBW细胞的非抗原特异性结合中起作用。然而，验证这一假设需要对DCmPs进行高分辨率的表征，这超出了本研究的范围。未来的研究还需进一步阐明辅助分子在T细胞结合中的作用。尽管如此，我们的数据清楚地表明，DCmPs在体外能够特异性结合抗原特异性T细胞，并通过抗原呈递激活T细胞。

### 5. 结论

我们系统地比较了三种包裹方法（超声波处理、挤出法和组合方法）在制备DCmPs中的应用，并证实组合方法在控制颗粒尺寸方面表现最佳，且在蛋白包裹量上优于挤出法。通过使用DC2.4细胞作为检测工具，我们确认了所有三种包裹方法在PLGA纳米颗粒上的蛋白包裹水平相似，而最终产物中仍含有未结合的蛋白和少量未包裹的颗粒。通过Western blot和流式细胞术分析，我们证实了DCmPs上存在呈递相关蛋白，并且LPS刺激显著提高了这些蛋白的包裹量。最终，DCmPs能够特异性结合抗原特异性T细胞，并通过抗原呈递激活T细胞。这些发现为膜包裹颗粒的开发建立了一种新的包裹策略和表征方法，并展示了DCmP技术在抗原特异性治疗中的潜力。