改进的核苷（2′-脱氧）核糖转移酶在保持催化效率的同时增强了酶的通用性

《ACS Chemical Biology》：Improved Nucleoside (2′-Deoxy)Ribosyltransferases Maximize Enzyme Promiscuity while Maintaining Catalytic Efficiency

核苷类似物合成酶工程研究通过改造高温古菌和低温古菌的2′-脱氧核苷转移酶（CtNDT和BpNDT），显著提升其催化3'-脱氧核苷和核苷的效率。结构生物学分析表明关键突变位点（如Y7F、A9S）改变底物结合口袋的构象和静电环境，结合动力学参数优化反应条件（pH、温度、底物比例），成功生产40余种新型核苷类似物，部分为首次合成。成果为生物催化合成抗肿瘤和抗病毒药物提供了新策略。

　　核苷类似物（Nucleoside Analogues, NAs）作为一类重要的化学分子，在过去的六十年中被广泛应用于癌症、病毒和细菌感染的治疗。这类化合物通常由核苷和核碱基组成，具有显著的生物活性，尤其在抗病毒药物和抗癌药物中扮演着关键角色。然而，传统化学合成方法在制备这些化合物时往往面临复杂的反应步骤和高昂的成本，导致合成效率较低，且难以大规模生产。因此，近年来科学家们开始探索利用酶催化的方式，以提高合成效率并降低生产成本。

核苷2′-脱氧核苷转移酶（Nucleoside 2′-Deoxyribosyltransferase, NDT）是一种具有广阔底物适应性的酶，能够催化多种类型的核苷合成反应。这类酶在自然界中广泛存在，其中一些来源于极端环境中的微生物，如嗜热菌 *Chroococcidiopsis thermalis* PCC 7203（简称 *Ct*NDT）和嗜冷耐受菌 *Bacillus psychrosaccharolyticus*（简称 *Bp*NDT）。研究者通过分析这些酶的结构，设计出多种突变体，以增强其对3′-脱氧核苷和核苷的催化效率，同时保持其对多种核碱基的适应性，从而生成超过100种不同的核苷产物。这种酶工程方法不仅提高了核苷合成的效率，还为未来的生物催化研究提供了新的思路。

为了实现这一目标，研究者首先对 *Ct*NDT 和 *Bp*NDT 的天然底物适应性进行了深入研究。结果显示，*Ct*NDT 更倾向于催化嘌呤类的2′-脱氧核苷合成，而 *Bp*NDT 则更适应于催化嘧啶类的2′-脱氧核苷。这两种酶都能够利用广泛的非典型核碱基作为底物，其中 *Ct*NDT 的底物适应性更为广泛。这一发现为后续的酶改造提供了基础，使得研究者可以进一步优化酶的催化能力，以适应更多类型的核苷底物。

为了提高 *Ct*NDT 对3′-脱氧核苷和核苷的催化效率，研究者基于其结构设计了一系列突变体。其中，*Ct*NDT 的某个关键酪氨酸（Y7）被替换为苯丙氨酸（F），从而增强了其对核苷的催化能力。这一突变不仅改善了酶的底物适应性，还提高了其对3′-脱氧核苷的转化效率。此外，研究者还对 *Ct*NDT 的其他关键残基进行了改造，如丝氨酸（S9）和缬氨酸（V85），以进一步优化其对糖结构的适应性。通过这些突变，研究者能够更有效地催化不同类型的核苷合成反应，从而生成更多的核苷类似物。

研究者还对 *Ct*NDT 的结构进行了详细分析，以理解其如何适应不同的底物。通过结晶学方法，研究者获得了 *Ct*NDT 突变体与核苷类似物结合的结构，揭示了其在催化过程中如何调整底物结合口袋，以容纳更复杂的底物。这一发现不仅为酶的结构-功能关系提供了新的视角，也为未来的酶工程研究提供了重要的理论支持。

此外，研究者还探讨了反应条件对核苷合成效率的影响。包括pH值、温度、底物浓度以及使用耦合酶等策略，都被用来调控反应平衡，以提高目标产物的生成率。例如，通过调整pH值和温度，研究者能够优化反应条件，使得核苷的合成效率显著提高。同时，研究者还发现，使用耦合酶可以进一步提高反应的转化率，尤其是在早期时间点。

研究者还对 *Bp*NDT 进行了类似的改造，以提高其对核苷的适应性。通过将 *Bp*NDT 的某个关键酪氨酸（Y5）替换为苯丙氨酸（F），研究者成功地提高了其对核苷的催化能力。这一突变体能够催化多种类型的核苷合成反应，包括5-氟尿苷的生成。然而，与 *Ct*NDT 相比，*Bp*NDT 的底物适应性较窄，因此在生成新的核苷类似物方面存在一定的局限性。

为了进一步验证这些酶的催化能力，研究者对 *Ct*NDT 和 *Bp*NDT 的多种突变体进行了系统的测试。结果显示，不同的突变体在催化效率和底物适应性方面表现出显著的差异。例如，*Ct*NDT 的某个突变体在催化3′-脱氧核苷时表现出更高的效率，而 *Bp*NDT 的某个突变体则在催化核苷时表现出更高的适应性。这些结果表明，通过结构分析和突变设计，可以显著提高核苷合成的效率和多样性。

研究者还对反应条件进行了系统的优化，包括pH值、温度、底物浓度以及反应时间等。通过调整这些条件，研究者能够提高反应的转化率和产物的纯度。例如，在特定的pH值和温度下，反应的转化率可以达到99%，这表明反应条件对产物生成具有重要的影响。此外，研究者还发现，使用不同的底物比例和反应时间，可以进一步优化反应条件，使得核苷的合成效率显著提高。

在研究过程中，研究者还探讨了不同底物对反应效率的影响。例如，某些非典型核碱基，如6-(苯基氧基)嘌呤和3-氨基吡啶-2(1H)-酮，被成功地用于核苷的合成。这些底物的使用不仅拓宽了核苷合成的范围，还为未来的药物开发提供了新的思路。此外，研究者还发现，某些核碱基的使用会导致反应效率的下降，因此需要对这些底物进行筛选和优化。

研究者还对 *Ct*NDT 的催化效率进行了系统的分析，以理解其如何适应不同的底物。通过测定不同底物的催化效率，研究者发现，某些底物的使用会导致催化效率的下降，而另一些底物的使用则会显著提高催化效率。这些结果表明，酶的催化效率与底物的结构和性质密切相关，因此需要对底物进行系统的筛选和优化。

研究者还对反应的副产物进行了分析，以理解其对反应效率的影响。例如，某些底物的使用会导致副产物的生成，从而影响反应的转化率。这些副产物的生成不仅需要进行有效的去除，还需要对反应条件进行优化，以减少副产物的生成。此外，研究者还发现，某些底物的使用会导致反应的副产物比例增加，因此需要对这些底物进行筛选和优化。

研究者还对反应的稳定性进行了分析，以理解其在不同条件下的表现。例如，某些酶在特定的pH值和温度下表现出更高的稳定性，而另一些酶则在特定的条件下表现出较低的稳定性。这些结果表明，酶的稳定性与反应条件密切相关，因此需要对反应条件进行优化，以提高酶的稳定性。此外，研究者还发现，某些酶在特定的反应条件下表现出更高的催化效率，而另一些酶则在特定的条件下表现出较低的催化效率。

通过这些研究，研究者不仅提高了核苷合成的效率，还拓宽了核苷合成的范围，为未来的药物开发提供了重要的理论支持。这些成果表明，通过结构分析和突变设计，可以显著提高酶的催化效率和底物适应性，从而生成更多的核苷类似物。此外，这些研究还为未来的酶工程研究提供了重要的指导，使得科学家们能够更有效地利用这些酶进行核苷的合成和改造。