源自人类间充质干细胞的囊泡，含有miR-13474基因，可作为治疗性递送载体，通过靶向CPEB2/TWIST1轴促进糖尿病伤口愈合

《ACS Applied Bio Materials》：Human Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes Endowed with miR-13474 as a Therapeutic Delivery Vehicle for Diabetic Wound Healing by Targeting the CPEB2/TWIST1 Axis

糖尿病伤口愈合过程中，高血糖导致皮肤结构破坏和纤维细胞功能障碍。研究证实，脐带间充质干细胞衍生外泌体（hucMSC-Ex）通过递送miR-13474靶向调控CPEB2/TWIST1轴，显著促进皮肤细胞增殖、迁移和胶原沉积，加速伤口愈合。电穿孔技术可有效负载miR-13474至外泌体，增强治疗效果。

　　糖尿病已成为全球范围内的重大公共卫生问题，其慢性性质使得相关并发症成为持续的挑战。在这些并发症中，糖尿病足溃疡（DFU）被认为是尤为严重的，有研究表明，几乎84%的非创伤性下肢截肢病例与DFU有关。DFU的形成受到多种机制的影响，包括神经病变、血管病理以及免疫紊乱，其中高血糖作为核心因素，不仅导致微血管损伤，还影响肌肉的代谢功能，从而加剧组织损伤。皮肤组织修复依赖于一系列复杂的生物学活动，如细胞迁移和增殖、细胞外基质（ECM）生成、血管生成以及组织重塑，这些过程协同作用以恢复组织的结构和功能完整性。然而，在慢性伤口中，这些阶段往往受到损害，尤其是在增殖和基质重塑阶段表现尤为明显。

在糖尿病患者的微环境中，糖化作用可能抑制细胞的增殖、迁移以及血管生成的能力。研究发现，来自患有慢性静脉功能不全的患者或缺乏瘦素受体的糖尿病小鼠的成纤维细胞在迁移方面存在显著缺陷。此外，高糖条件下，成纤维细胞产生的NO水平降低，而NO在成纤维细胞的增殖和功能中起着关键作用。这些细胞功能的障碍导致肉芽组织形成受阻和基质沉积不足，最终导致非愈合性伤口的形成。因此，恢复成纤维细胞在皮肤组织中的功能可能是促进糖尿病伤口愈合的关键步骤。

细胞疗法，尤其是间充质干细胞（MSC）的应用，被认为是推动再生过程的强大工具。越来越多的证据表明，MSC主要通过旁分泌机制恢复组织功能，而外泌体作为关键的介质，正受到广泛研究。几乎所有细胞类型都会释放外泌体，这些纳米级囊泡能够携带脂质、代谢物、核酸和蛋白质等分子货物。通过这些分子，外泌体能够建立一种既局部又远端的通讯系统，从而发挥其多样化的生物学效应。MSC来源的外泌体（MSC-Ex）在功能上与MSC相似，甚至更为优越。外泌体的优势包括脂质双分子层保护其货物免受快速降解、较少引发免疫反应、体积小、高稳定性以及易于储存。与合成纳米颗粒（如金属纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和碳基纳米颗粒）相比，外泌体更为天然，更安全，并且具有一定的靶向性，以及穿过生物屏障如血脑屏障的能力。当纳米颗粒被引入血管系统后，血清中的蛋白质会迅速结合到其表面，形成蛋白冠，而外泌体则显示出较弱的非特异性与血清蛋白的相互作用。这表明，外泌体在体内可能具有更优的生物分布和安全性。

研究发现，外泌体可以作为天然生物颗粒，其分子负载可以被设计和工程化，包括药物、免疫调节因子、功能蛋白和RNA等。外泌体结合了高稳定性和生物相容性，使其成为功能性负载的理想载体。此外，其内源性成分可能进一步促进更好的生物分布和安全性。这些特性使得外泌体成为糖尿病足溃疡治疗中“无细胞”策略的理想选择。

当前研究发现，微小RNA（miRNA）在糖尿病伤口修复的整体过程中起着关键的调节作用。基于这一发现，我们筛选出hucMSC来源的外泌体（hucMSC-Ex）在促进糖尿病伤口愈合中的关键miRNA。通过小RNA测序和生物信息学分析，我们发现hucMSC-Ex中miR-13474的表达显著增加，且其表达水平在高糖处理的皮肤细胞以及糖尿病足溃疡大鼠中均出现下降。同时，miR-13474在糖尿病足溃疡患者的伤口区域和边缘表现出显著的表达差异，这表明其在临床中的潜在价值。进一步的实验发现，阻断miR-13474会明显削弱hucMSC-Ex的治疗效果，这说明miR-13474在其中发挥着至关重要的作用。

此外，研究发现hucMSC-Ex通过靶向CPEB2/TWIST1轴来改善受损皮肤细胞的功能。这一轴在伤口修复过程中起着重要作用，而miR-13474能够通过直接结合CPEB2并调控其表达，进而影响TWIST1的表达水平。双荧光素酶报告基因实验进一步验证了miR-13474与CPEB2之间的直接调控关系。同时，TWIST1的敲低会损害成纤维细胞的增殖、迁移能力以及细胞活力，而miR-13474的过表达则能够逆转这种损害。这些结果表明，miR-13474通过调控CPEB2/TWIST1轴，显著改善了成纤维细胞的功能。

为了进一步验证miR-13474的治疗潜力，我们通过电穿孔技术将miR-13474模拟物封装到hucMSC-Ex中，以提高其在体内外的生物功能。实验结果显示，封装miR-13474的hucMSC-Ex在促进成纤维细胞的增殖、迁移能力以及血管生成方面表现出更优的效果。同时，在糖尿病足溃疡大鼠模型中，miR-13474修饰的hucMSC-Ex能够显著改善伤口愈合情况，包括组织结构的恢复和新生血管的形成。相比之下，普通外泌体或生理盐水注射未能达到同样的效果，这表明miR-13474的引入对于提高hucMSC-Ex的治疗效果至关重要。

在组织学分析中，miR-13474修饰的hucMSC-Ex治疗的糖尿病足溃疡大鼠皮肤表现出更正常的表皮层结构和厚度，以及丰富的附属结构，如毛囊和汗腺，这些在对照组中几乎缺失。此外，miR-13474修饰的外泌体还能促进与增殖和凋亡相关的蛋白表达，从而提高细胞活力并降低细胞凋亡风险。这些结果表明，miR-13474修饰的hucMSC-Ex能够有效改善糖尿病足溃疡的修复过程。

研究还发现，hucMSC-Ex在体外和体内均能显著促进伤口愈合。在糖尿病足溃疡大鼠模型中，hucMSC-Ex治疗组的伤口闭合率显著高于对照组，尤其是在伤口形成后的第7到第10天，这种促进作用最为明显。这与之前的研究结果一致，即伤口周围的成纤维细胞在受伤后迅速激活，α-SMA的表达在伤口形成后约一周达到高峰。通过免疫组化分析，我们发现hucMSC-Ex能够促进表皮细胞的增殖，并改善胶原沉积和组织结构的恢复。同时，hucMSC-Ex还能够促进血管生成，提高血管密度和血管完整性，从而为伤口提供更多的营养和氧气。

在细胞水平上，hucMSC-Ex能够显著提高成纤维细胞的增殖、迁移能力以及细胞活力。在高糖环境下，这些细胞的功能受到抑制，而hucMSC-Ex的治疗能够有效逆转这种抑制作用。此外，hucMSC-Ex还能够通过调控炎症因子的表达，减少炎症反应，从而促进伤口愈合。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot分析，我们发现hucMSC-Ex能够显著降低促炎因子（如IL-1、IL-6和IL-8）的表达，同时提高抗炎因子（如IL-10）的表达水平。这些结果表明，hucMSC-Ex不仅能够直接改善成纤维细胞的功能，还能通过调节炎症反应间接促进伤口修复。

研究还发现，hucMSC-Ex通过电穿孔技术装载miR-13474后，其在促进细胞功能方面的效果更加显著。在细胞模型和糖尿病足溃疡大鼠中，miR-13474修饰的hucMSC-Ex能够显著提高细胞活力、增殖能力和迁移能力。同时，这些外泌体还能增强血管内皮细胞的管状结构形成能力，从而促进血管生成。在糖尿病足溃疡大鼠的组织学分析中，miR-13474修饰的hucMSC-Ex能够显著改善皮肤结构，使其恢复接近正常状态。相比之下，普通外泌体或生理盐水注射未能达到这种效果，进一步证明miR-13474在伤口修复中的关键作用。

在分子机制方面，研究发现miR-13474能够通过靶向CPEB2/TWIST1轴来改善成纤维细胞和血管内皮细胞的功能。CPEB2是一种高度保守的细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白，其在miR-13474调控下的表达水平变化可能影响TWIST1的表达，进而影响细胞的增殖、迁移和胶原分泌能力。通过双荧光素酶报告基因实验，我们确认了miR-13474与CPEB2之间的直接调控关系。此外，TWIST1的表达水平变化也与miR-13474的调控密切相关，其在高糖环境下的上调可能与伤口修复过程中的细胞活动有关。

综上所述，本研究揭示了hucMSC-Ex在糖尿病伤口修复中的作用及其潜在的分子机制。通过调控CPEB2/TWIST1轴，miR-13474能够显著改善成纤维细胞和血管内皮细胞的功能，从而促进伤口的修复。此外，通过电穿孔技术将miR-13474装载到hucMSC-Ex中，能够进一步提高其治疗效果。这些发现不仅为糖尿病足溃疡的治疗提供了新的思路，也为开发基于细胞外泌体的无细胞治疗策略奠定了基础。未来的研究可以进一步探索miR-13474与其他miRNA之间的协同作用，以及其在不同组织中的具体靶向机制，以期实现更高效的糖尿病伤口修复。