热诱导乳铁蛋白结构变化以增强黏膜粘附性

《ACS Applied Bio Materials》：Heat-Induced Structural Changes in Lactoferrin for Enhanced Mucoadhesion

本研究通过热处理调控乳铁蛋白（LF）的结构，发现高温处理（如95°C）导致LF聚集并暴露疏水表面，增强其与牛下颌粘液（BSM）的吸附能力，表现为流变学特性的显著变化。实验结合圆二色光谱、动态光散射、原子力显微镜和石英晶体微天平技术，揭示了疏水相互作用在LF-BSM粘附中的主导作用，为设计天然蛋白质基生物粘附剂提供了新思路。

　　本研究探讨了乳铁蛋白（Lactoferrin, LF）在热处理后如何影响其与黏蛋白（mucin）的黏附特性。黏附是材料与黏膜表面相互作用的一种重要机制，广泛应用于医药、生物医学和食品科学等领域。黏蛋白作为黏液的主要结构成分，具有丰富的功能基团，能够通过多种分子间作用力进行交互。LF作为一种天然存在的两性分子，其黏附能力一直受到关注，但其在热处理后如何影响与黏蛋白的结合行为，尚缺乏系统研究。本文通过多种实验方法，包括圆二色谱（CD）、动态光散射（DLS）、原子力显微镜（AFM）、流变学分析和石英晶体微天平（QCM-D）等，揭示了LF在不同热处理条件下的结构变化及其与黏蛋白的结合机制。研究发现，LF在热处理后与黏蛋白的结合能力增强，其黏附机制主要依赖于疏水相互作用，而非传统的静电相互作用。这些发现为设计和优化基于天然蛋白质的黏附系统提供了新的思路，特别是在药物输送和黏膜保护领域。

LF作为一种具有铁结合能力的蛋白质，广泛存在于哺乳动物的泪液、唾液和乳汁中。其分子量约为80 kDa，天然状态下的等电点（IEP）在pH 8左右。而热变性温度则因铁饱和度不同而有所差异，一般在61到82 °C之间。根据文献报道，apo-LF（铁自由形式）的变性温度在60-61 °C，而holo-LF（铁饱和形式）则在89-91 °C。由于LF具有铁饱和和铁脱饱和的两个结构域，其天然状态下的变性温度范围也涵盖了这两个区间。LF在热处理过程中会经历结构展开，形成更加灵活的构象，同时暴露疏水残基并形成聚集结构。尽管目前对LF铁结合特性的研究较为完善，但其与黏蛋白相互作用的变化仍处于初步探索阶段。为了充分利用LF作为黏附材料的潜力，理解热处理如何改变其结构并影响黏附性能至关重要。

本研究采用了多种技术手段，系统评估了热处理对LF与黏蛋白相互作用的影响。其中包括使用QCM-D技术实时监测LF-黏蛋白复合物的吸附动力学、粘弹性特性以及水合质量；利用CLSM技术观察LF与黏蛋白混合物的微观结构；并使用流变学分析评估其在不同剪切速率下的流体行为。通过这些方法，我们发现LF在热处理后与黏蛋白的结合能力显著增强，特别是在95 °C的条件下。此外，LF在热处理后表现出较高的表面活性，能够诱导一种类似剪切变稀的流变学响应。虽然之前认为LF的黏附机制主要依赖于静电相互作用，但本研究强调了疏水相互作用在LF-黏蛋白结合中的关键作用。这一发现为设计新的基于天然蛋白质的黏附系统提供了理论依据。

在本研究中，我们还对LF在不同热处理温度下的结构变化进行了深入分析。通过CD光谱分析，我们发现LF在热处理后其二级结构发生显著变化，α-螺旋和β-折叠结构逐渐减少，这表明其分子结构在热处理过程中发生了部分展开。而在近紫外区的CD光谱中，LF的三级结构也发生了变化，尤其是芳香残基的排列和二硫键的分布。这些结构变化不仅影响LF的物理性质，还可能改变其与黏蛋白的结合方式。此外，通过DLS技术测量了LF在不同温度下的水动力直径，结果显示LF在65 °C时开始聚集，而在95 °C时形成更大的聚合体。这表明热处理能够显著改变LF的聚集状态，进而影响其黏附行为。

在表面特性方面，我们通过ζ-电位测定发现LF在pH 7.0时呈正电性，且热处理后其表面电荷分布有所变化。然而，这种变化并非主要由电荷分布导致，而是与LF的疏水性增强有关。通过ANS荧光测定，我们发现LF在热处理后其表面疏水性显著增加，其中在95 °C时增加最为明显。这一现象可能与LF结构展开后暴露更多的疏水区域有关。AFM图像进一步证实了这一结论，显示LF在热处理后形成更大的聚集结构，这与热处理导致的疏水相互作用增强一致。

此外，我们还对黏蛋白（BSM）的结构和性质进行了分析。BSM是一种高度糖基化的蛋白质，其分子量较大，具有丰富的功能基团，能够与多种分子相互作用。通过SDS-PAGE和AF4-MALS技术，我们发现BSM主要由多种不同分子量的寡聚体组成，其结构呈扩展的随机卷曲构型。这些特性可能影响其与LF的结合方式。我们进一步发现，LF与BSM的结合行为受到其结构变化的显著影响，尤其是在热处理后的LF中，由于疏水相互作用的增强，其与黏蛋白的结合能力显著提升。

通过QCM-D实验，我们观察到LF在热处理后其与黏蛋白的结合能力增强，表现为更大的频率偏移（Δf）和更高的水合质量。这表明热处理后的LF在黏蛋白表面具有更强的吸附能力。此外，流变学分析显示，LF与BSM混合后，其粘弹性特性显著增强，特别是在95 °C热处理后的LF中，其与黏蛋白形成的复合物表现出更高的粘度。这种粘度增强现象可能与LF在热处理后形成的网络结构有关，这种结构能够有效增强其与黏蛋白的相互作用。而这些相互作用的增强，可能是由于LF结构展开后暴露了更多的疏水区域，从而增加了与黏蛋白的结合面积。

值得注意的是，LF的热处理不仅影响其与黏蛋白的结合能力，还可能改变其在实际应用中的行为。例如，在流变学测量中，LF的剪切变稀行为可能受到界面效应的影响。通过引入表面活性剂Triton X-100，我们发现LF在空气-水界面的吸附行为是导致剪切变稀现象的重要因素。然而，表面活性剂在LF-BSM混合物中的使用受到限制，因为它们可能与黏蛋白发生复杂的相互作用，影响实验结果。因此，在解释LF-BSM体系的流变行为时，需要综合考虑界面效应和bulk行为。

综上所述，本研究揭示了LF在热处理后的结构变化如何影响其与黏蛋白的结合能力。LF的热处理能够诱导其结构展开，增加疏水区域的暴露，从而增强其与黏蛋白的相互作用。这种增强的结合能力不仅体现在更高的吸附量上，还表现为更强的黏附力和更高的粘度。尽管LF的热处理可能改变了其表面电荷分布，但其与黏蛋白的结合主要依赖于疏水相互作用，而非传统的静电相互作用。这些发现为基于天然蛋白质的黏附系统的设计提供了新的思路，尤其是在需要增强黏附能力的医药和食品科学应用中。

此外，本研究还强调了LF在热处理后可能形成的网络结构对其黏附行为的影响。这种网络结构可能在黏液环境中提供额外的支撑力，增强其与黏蛋白的相互作用。通过CLSM技术，我们观察到LF在热处理后形成的复合物具有更复杂的微观结构，这些结构可能在剪切过程中表现出不同的流变行为。因此，在实际应用中，需要综合考虑LF的热处理条件和其在不同环境下的行为特性。

本研究的结果不仅有助于理解LF在热处理后的结构变化及其与黏蛋白的相互作用机制，还为设计和优化基于天然蛋白质的黏附系统提供了理论依据。通过调控LF的结构状态，可以有效增强其与黏蛋白的结合能力，从而改善其在生物医学和食品科学中的应用性能。然而，LF在体内的黏液环境可能更为复杂，因此未来的研究需要进一步探索其在不同生理条件下的行为特性，以实现更精确的黏附性能调控。