通过内化的双光子激活分子纳米机器，利用IV型光动力疗法实现程序性细胞死亡

《ACS Applied Bio Materials》：Programmed Cell Death via Type IV Photodynamic Therapy Using Internalized Two-Photon Activated Molecular Nanomachines

光动力疗法（PDT）通过分子纳米机器（MNMs）的近红外（NIR）激活实现低损伤细胞死亡，MNMs经PEG和TPP+功能化后可主动内化并靶向线粒体，通过可控的机械损伤诱导凋亡而非坏死，减少炎症反应。

　　光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）作为一种新兴的癌症治疗手段，近年来受到了广泛关注。与传统的间接光动力疗法不同，直接光动力疗法（Direct PDT）通过光敏剂（Photosensitizer, PS）本身在细胞内部的结构变化来触发治疗效果，而不依赖于氧气与光敏剂之间的反应生成活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）。这种技术的优势在于其对细胞膜的破坏性较低，从而显著减少了对非目标细胞的损害。随着研究的深入，科学家们正在探索一种新的PDT方法，即利用光激活的分子纳米机器（Molecular Nanomachines, MNMs）进行治疗，这种方法不仅可以靶向特定的细胞，还可以在不同的光照条件下，选择性地诱导不同的细胞死亡方式，如程序性细胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）或坏死（Necrosis）。

分子纳米机器作为一种可被光激活的机械系统，其设计灵感来源于自然界中的分子运动机制。这些纳米机器通常由一个固定的“定子”（Stator）和一个可旋转的“转子”（Rotor）组成，通过光照引发结构变化，从而启动转子的旋转。这种旋转能够对细胞结构造成物理性损伤，进而导致细胞死亡。在之前的研究中，已成功利用这种技术诱导细胞膜的破坏，引发坏死性细胞死亡。然而，坏死过程通常伴随着细胞内容物的泄漏，可能引发免疫反应和炎症，这在临床应用中可能带来额外的副作用。因此，探索一种能够诱导更温和、更可控的程序性细胞死亡方式，成为了当前研究的一个重要方向。

在这一背景下，研究团队提出了一种新的分子纳米机器设计，其核心结构保留了原有的光响应特性，但通过引入特定的化学修饰，如聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）和三苯基膦（Triphenylphosphonium, TPP+）基团，使得纳米机器能够更有效地穿透细胞膜并定位在细胞内的特定部位，如线粒体膜。这种设计不仅增强了纳米机器的细胞内化能力，还使得其在细胞内部的激活成为可能，从而减少对细胞膜的破坏，避免坏死性细胞死亡的发生。此外，PEG修饰通常用于改善药物的生物相容性和渗透性，而TPP+则因其对线粒体的亲和力，成为一种有效的靶向载体。

研究团队利用NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，通过一系列实验验证了这些新型分子纳米机器的功能。首先，他们确认了这些纳米机器在细胞膜上的结合能力，以及其在细胞内的分布情况。通过使用不同波长的光激活（如355 nm的紫外光和710 nm的近红外光），他们观察到纳米机器在不同光照条件下表现出不同的细胞死亡机制。当使用紫外光激活时，纳米机器的转子运动导致细胞膜破裂，引发坏死性细胞死亡；而当使用近红外光激活时，纳米机器能够更温和地作用于细胞内部，尤其是线粒体区域，从而诱导程序性细胞死亡，如凋亡（Apoptosis）。

在凋亡检测方面，研究团队采用了Annexin V Alexa Fluor 488（AVAF）这一荧光探针。Annexin V能够特异性地结合细胞膜外侧暴露的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PtdSer），这是凋亡细胞的一个重要标志。通过与AVAF结合，研究人员能够更准确地检测细胞是否经历了凋亡。然而，实验中也发现，即使在纳米机器被激活的情况下，AVAF信号的缺失可能表明凋亡过程并未完全被检测到，或者细胞在凋亡过程中未及时将PtdSer暴露在细胞膜表面。因此，研究团队建议结合其他凋亡标志物，如激活的半胱天冬酶（Caspase）、细胞色素c（Cytochrome c）和线粒体功能检测（如MTT法），以更全面地评估凋亡的发生。

此外，研究团队还进行了清除实验，以评估这些纳米机器在细胞内的代谢情况。结果显示，即使在未激活的情况下，TPP+修饰的分子纳米机器（MNM 4）也能够被细胞主动清除，这表明其在细胞内的行为符合生物体的自然代谢机制。而当这些纳米机器被激活后，其作用时间的控制显得尤为重要。如果激活时间过长，可能会导致细胞膜的不可逆破坏，进而引发坏死；如果激活时间较短，则可能不足以触发细胞死亡，或者仅诱导部分程序性死亡机制。因此，确定最佳的激活时间和条件，是实现精准治疗的关键。

实验中还发现，TPP+修饰的纳米机器在激活后能够更有效地定位在细胞的线粒体膜上，并通过机械作用对线粒体造成损伤。这种损伤可能触发多种程序性细胞死亡机制，而不仅仅是凋亡。例如，线粒体膜的损伤可能导致细胞凋亡、自噬（Autophagy）或线粒体凋亡途径（Mitochondrial Apoptosis Pathway）的激活。这些发现为未来开发更精确的细胞靶向治疗策略提供了重要的理论基础。

值得注意的是，尽管TPP+修饰的纳米机器能够诱导程序性细胞死亡，但其在细胞内的作用机制仍需进一步研究。例如，TPP+与线粒体之间的相互作用是否仅限于静电吸引，还是涉及更复杂的分子识别过程？此外，不同修饰基团对纳米机器在细胞内的分布和功能的影响，也需要更深入的探讨。这些研究不仅有助于理解纳米机器在细胞内的行为，还可能为优化其设计和应用提供新的思路。

总的来说，这项研究为光动力疗法提供了一种新的方向，即通过分子纳米机器的内部激活，实现更精准、更安全的细胞死亡诱导。这种方法的优势在于其对细胞膜的破坏性较低，从而减少了治疗过程中的副作用。同时，通过调整光照条件，可以灵活选择不同的细胞死亡机制，以适应不同的治疗需求。尽管目前的研究主要集中在体外实验，但未来的研究将致力于将其应用于体内环境，探索其在实际临床中的潜力。此外，随着对纳米机器生物相容性和代谢途径的进一步研究，这项技术有望成为一种安全、高效的癌症治疗手段。