整合膜金属酶UndB的工程设计及无细胞生物催化平台的设计，实现了高效的1-烯烃生产

《ACS Central Science》：Engineering of Integral Membrane Metalloenzyme UndB and Designing of a Cell-Free Biocatalytic Platform Enabled Efficient 1-Alkene Production

细胞-free生物催化平台通过整合UndB酶与NADPH再生系统及催化酶，显著提升1-烯烃产率（3412-fold），并发现关键结构域（158-189）决定底物特异性，工程化后实现长链脂肪酸（如棕榈酸）高效转化为高值1- pentadecene（98%产率，0.05%催化剂负载）。离子配对网络（Arg121/R246/E85/R112等）及底物结合腔动态调节机制被分子动力学模拟揭示。

　　生物合成1-烯烃（1-alkenes）在当今全球范围内备受关注，因为它们具有作为绿色商品化学品和下一代“可替代”生物燃料的潜力。本文提出了一种工程策略，旨在提高膜结合金属酶UndB的催化活性和底物特异性，从而显著提升其在生物催化1-烯烃生产中的应用价值。我们开发了一种高效且基于UndB的细胞外生物催化平台，用于高产率中链1-烯烃的合成。该系统在1-十一烯（1-undecene）生产中实现了262倍的UndB活性提升，总转化次数达到3412次。通过分析UndB家族的结构，我们对UndB进行了结构域交换（domain-swapping）工程，增强了其对自然界中丰富存在的长链脂肪酸的选择性，从而实现高效的长链1-烯烃生产。大规模的分子动力学（MD）模拟揭示了底物与蛋白相互作用中至关重要的离子对网络，为底物稳定提供了理论框架。我们还识别出一个高度动态且功能关键的精氨酸残基（Arg121），它在底物摄取和稳定过程中起着决定性作用，提供了对UndB底物识别机制的深入理解。此外，模拟结果表明，底物结合口袋体积的精确调控是UndB不同变体之间底物特异性的关键决定因素，揭示了UndB家族在进化适应性方面的潜在机制。我们的系统在仅使用0.04 mol%催化剂负载的情况下，实现了高达98%的1-烯烃产率，并且在温和条件下表现出色，展示了其作为绿色生产策略的巨大前景。

本文研究的重点在于通过工程手段优化UndB的催化性能，从而实现高效的1-烯烃生物合成。传统的石油基化学品和燃料生产方式依赖于化石燃料，反应条件通常较为严苛，使用昂贵的金属催化剂，并且会产生不必要的副产物。这些方法不仅对环境造成负担，也存在效率方面的限制。相比之下，基于生物酶的系统能够以温和的条件进行反应，具有高选择性和特异性，从而成为替代传统化学方法的可持续方案。UndB是一种整合膜金属酶，属于脂肪酸脱饱和酶（FADS）超家族，其催化中心为非血红素二铁（nonheme diiron）。该酶能够在无需外部氧化还原伙伴或电子供体的情况下，利用氧气和还原性电子传递系统将脂肪酸转化为1-烯烃。然而，此前研究发现，纯化的UndB在转化过程中表现出较低的活性，总转化次数（TTN）仅为13，这一限制因素显著阻碍了其在大规模应用中的潜力。为了解决这一问题，我们通过融合大肠杆菌（*E. coli*）的催化酶基因*katE*到UndB的N端，成功提升了其催化效率，使TTN达到约270次。这一成果为后续的进一步优化奠定了基础。

在本研究中，我们通过结合UndB与两种共底物循环系统，开发出一种稳定的细胞外生物催化（CFB）平台，该平台显著提高了这种膜结合酶的活性，使1-十一烯的总转化次数达到3412 ± 254，创下了目前基于UndB的中链1-烯烃生产的最佳记录。然而，该系统在长链1-烯烃的生产方面仍然存在一定的局限性。为了解决这一问题，我们对UndB的同源蛋白进行了结构多样性分析，并确定了一个关键的结构区域，该区域决定了UndB的底物特异性。随后，我们通过有策略的结构域交换工程对这一结构区域进行了改造，使得UndB能够更高效地利用自然界中更丰富的长链脂肪酸，从而实现高价值长链1-烯烃的高效生产。此外，我们通过大规模的分子动力学（MD）模拟，揭示了UndB同源蛋白之间底物特异性的分子基础。

我们首先研究了UndB的底物范围，并发现其对中链脂肪酸（如十一烷酸）的转化效率显著高于对长链脂肪酸（如棕榈酸）的转化效率。这表明，UndB在结构上更倾向于与中链脂肪酸结合。为了进一步提升其对长链脂肪酸的催化能力，我们通过结构域交换的方式，将Class II UndB（如来自*Paraglaciecola psychrophile*的Pps-UndB）的特定结构域引入到Class I UndB（如来自*Pseudomonas mendocina*的Pme-UndB）中，从而构建出一种新的酶变体εPme-UndB。这一工程化酶在与长链脂肪酸结合时表现出更高的活性，特别是在棕榈酸的转化过程中，其TTN达到了2952 ± 254，比原始Pme-UndB的1152 ± 108有了显著提升。同时，εPme-UndB在长链1-烯烃的生产中也表现出更高的效率，其在温和条件下实现了高达98%的1-十五烯（1-pentadecene）产率，并且仅需极低的催化剂负载（0.05%）。这一结果进一步验证了结构域交换工程在提升UndB底物特异性方面的有效性。

为了深入理解UndB的底物特异性机制，我们进行了全原子级别的分子动力学（MD）模拟，研究了其在脂质双分子层中的底物结合过程。模拟结果显示，UndB的底物结合口袋体积在不同变体之间存在显著差异。例如，εPme-UndB和Pps-UndB的结合口袋体积更大，这有助于其对长链脂肪酸（如棕榈酸）的高选择性。相比之下，Pme-UndB的结合口袋体积较小，因此更倾向于与中链脂肪酸（如十一烷酸）结合。这一发现为理解UndB的底物识别机制提供了重要线索。此外，我们还观察到，UndB的底物结合过程中存在一个高亲和力结合位点，该位点距离二铁中心约14 ?，并且通过离子对网络与多个关键残基相互作用，如精氨酸121（R121）、谷氨酸85（E85）、精氨酸246（R246）和谷氨酸139（E139）。这些残基的相互作用对于底物的稳定和催化效率至关重要。值得注意的是，R121是一个高度动态的残基，它不仅在高亲和力结合位点中起作用，还在靠近二铁中心的结合位点中发挥作用，这表明它在底物识别和稳定过程中具有双重功能。

我们还发现，水分子在UndB与底物的相互作用中扮演了重要角色。在未结合底物的情况下，UndB的结合口袋被水分子完全占据，形成了一个从溶剂到二铁中心的连续通道。然而，当底物结合后，该通道的水分子渗透性显著降低，但并未完全封闭。这一变化可能影响底物的扩散和结合效率，进而影响催化反应的整体性能。通过改变膜组成（如POPE:POPG的比例从4:1调整为7:3），我们进一步验证了结合口袋体积对底物特异性的影响，这表明UndB的结构域交换不仅改变了其结合口袋的体积，还可能通过调节脂质双分子层的相互作用，影响其对不同链长脂肪酸的选择性。

此外，我们还研究了UndB的离子对网络如何影响底物的结合和稳定。这一网络由多个带电残基组成，包括天冬氨酸137（D137）、谷氨酸139（E139）、精氨酸121（R121）、谷氨酸85（E85）和精氨酸246（R246），它们共同作用，为底物提供了稳定的结合环境。为了验证这些残基在催化过程中的作用，我们对R121F突变体进行了实验分析，结果表明其活性大幅下降（<10%），进一步支持了R121在底物稳定中的关键作用。此外，我们还通过实验突变E139A和R121A，发现这些突变显著降低了1,7-辛二烯的生产效率，进一步强调了这些残基在催化过程中的重要性。

综上所述，本文通过结构域交换和分子动力学模拟，揭示了UndB的底物特异性机制，并成功开发出一种高效的细胞外生物催化平台，能够实现中链和长链1-烯烃的高产率生产。这一平台不仅显著提升了UndB的催化活性，还通过优化共底物循环系统，降低了对昂贵还原剂NADPH的依赖，从而提高了整体的经济性和环境友好性。我们的研究结果表明，UndB的底物特异性主要由其结合口袋体积的调控和离子对网络的形成所决定，这一发现为未来开发更高效的生物催化系统提供了理论依据和技术支持。同时，这一研究也为探索其他生物催化反应路径，如生产环烷烃、胺类、环丙烷和酯类等具有工业和医药价值的化合物，奠定了坚实的基础。