DAPI替代PI：多物种精子膜完整性流式检测新策略及其在畜牧业的应用

《Veterinary Research Communications》：Evaluating DAPI stain to assess sperm membrane integrity by flow cytometry in livestock species

本研究针对传统流式细胞术精子活力检测中碘化丙啶(PI)红色荧光通道易与其他染料重叠的问题，创新性地评估了蓝色荧光染料DAPI在三种家畜（山羊、兔、牛）精子膜完整性检测中的适用性。结果表明DAPI与PI检测结果高度相关（山羊r=0.87，兔r=0.86，牛r=0.83），且不受孵育时间影响，为多参数流式分析释放了红色通道，显著提升了家畜精子质量评估的技术灵活性。

　　

在畜牧业人工授精技术中，准确评估精子质量是预测受精潜力的关键环节。精子活力（质膜完整性）作为核心指标，与田间生育力结果密切相关。目前流式细胞术(Flow Cytometry, FC)常规使用碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)进行活力检测，但PI发射的红色荧光易与其他常用荧光染料光谱重叠，限制了多参数同步分析的能力。而蓝色荧光染料DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）因其独特的光谱特性，有望解决这一技术瓶颈。

研究人员针对三种重要经济动物（山羊、兔、牛）展开系统研究，通过三个系列实验验证DAPI的实用性。首先考察孵育时间对检测结果的影响，发现延长至3小时未引起精子膜通透性变化。随后在多物种样本中平行对比DAPI与PI的检测效能，证实两者呈显著正相关（山羊r=0.87，兔r=0.86，牛r=0.61）。特别在牛精液中发现种属特异性差异，可能与其染色质高度压缩特性相关。最后通过同步染色实验验证了DAPI/PI双染方案的可行性，为复杂样本分析提供了新思路。

关键技术方法包括：采集穆尔西亚诺-格拉纳达山羊新鲜精液、米格尔·埃尔南德斯大学兔场精液及商业冻存牛精液；使用BD LSRFortessa流式细胞仪配置五激光系统；分别优化DAPI（2.9μM）和PI（7.5μM）染色浓度；采用门控策略排除碎片和双联体；通过广义线性模型和Bland-Altman分析进行统计学验证。

Study 1: 孵育时间对牛精子活力率的影响

通过设置不同平衡时间（t0立即检测、t0+3染色后放置3小时、t3解冻后放置3小时再染色）对比发现，DAPI与PI在各时间点检测的活力率无显著差异（40.14-44.28%），证明DAPI染色稳定性不受时间因素干扰。

Study 2: 多物种中DAPI作为活力染料的效能

在694份样本（山羊418、兔115、牛161）中，DAPI与PI检测结果高度一致：山羊样本相关系数0.87（R²=0.76），兔样本0.86（R²=0.74），牛样本虽存在统计差异但仍保持显著相关（r=0.61）。Bland-Altman分析显示差异值均匀分布，无系统性偏差。

Study 3: 样本内变异对荧光染料相关性的影响

对158份牛精液进行同步双染发现，DAPI与PI仍保持高度相关（r=0.82），但出现约30%样本存在PI+/DAPI-细胞群。进一步分析提示可能与膜电位变化或染色质可及性相关，而非染料渗透性差异。

研究结论确认DAPI可作为PI的有效替代方案，其蓝色荧光特性释放了红色通道用于线粒体功能等关键参数检测。讨论部分深入分析了种属差异的潜在机制，包括牛精子染色质高压缩性可能影响DAPI与DNA小沟的结合效率。该技术突破为家畜精子多参数质控建立了新标准，尤其对偏远地区样本固定后延迟检测具有重要实践价值。论文发表于《Veterinary Research Communications》，为畜牧业繁殖技术提供了关键方法学支撑。