基于STR/SNP与DNA甲基化联合分析的法医DNA分型新方法开发与应用评估

《International Journal of Legal Medicine》：Linking STRs/SNPs and DNA methylation using massively parallel sequencing for potential forensic applications

本研究针对法医混合斑迹中体液来源与个体识别难以直接关联的难题，开发了一种基于亚硫酸氢盐转化和MPS技术，可同步分析STR基因座、iSNP及邻近DNA甲基化(tDMP)位点的创新流程。研究成功实现了18个STR在转化后DNA中的分型，并鉴定出多个具有体液差异性甲基化潜力的STR侧翼CpG位点，同时验证了已知tDMP-iSNP位点在混合样本贡献者分配中的价值。该方法为法医复杂生物检材的精准溯源提供了新的技术路径。

　　

在法医科学领域，对犯罪现场遗留的生物痕迹进行分析，不仅需要确定其来源个体，还需要明确这些生物材料来自何种体液（如血液、精液、唾液等），这对于重建案件事实至关重要。目前，主流的个体识别方法是短串联重复序列（Short Tandem Repeat, STR）分析，而体液鉴定则多依赖免疫学方法或RNA标记物分析。然而，这两种分析通常是独立进行的，导致体液类型与STR谱的贡献者之间只能建立间接的关联。尤其是在遇到含有不同体液的混合样本时，如何将特定的体液准确地“分配”给混合物中的特定贡献者，成为一个棘手的挑战。

DNA甲基化（DNA Methylation, DNAm）作为一种稳定的表观遗传标记，为体液鉴定提供了新的可能。某些CpG位点的甲基化水平具有组织特异性，被称为组织特异性差异甲基化位点（tissue-specific Differentially Methylated Positions, tDMP）。先前的研究尝试将tDMP与邻近的身份识别单核苷酸多态性（identity SNP, iSNP）结合，通过等位基因关联分析来链接贡献者与其体液。但是，iSNP的分辨率较低，且STR这一法医“金标准”尚未被整合到此类联合分析中。此外，对于亚硫酸氢盐转化后的DNA进行STR分析，以及在其侧翼区域探索DNA甲基化以用于法医目的，仍是一片未被充分探索的领域。

发表在《International Journal of Legal Medicine》上的这项研究，旨在填补这一空白。研究人员构想并验证了一种创新的分析流程，利用基于扩增子的亚硫酸氢盐大规模平行测序（Massively Parallel Sequencing, MPS）技术，首次尝试对法医常用STR在亚硫酸氢盐转化后的DNA中进行分型，并同步分析其邻近的CpG位点以及已知的tDMP-iSNP位点。这项研究不仅评估了该技术路线的可行性，更探索了其在混合斑迹分析中，将已知贡献者与其体液直接关联的应用潜力。

为开展此项研究，研究人员主要应用了几项关键技术：1) 从血液、精液、唾液等七种法医相关体液的志愿者样本中提取DNA并进行亚硫酸氢盐转化；2) 针对筛选出的22个STR和8个tDMP-iSNP位点设计引物，进行多重PCR扩增；3) 使用Illumina MiSeq FGx平台进行MPS测序；4) 开发并利用适配亚硫酸氢盐转化DNA的FDSTools软件包及其定制文库文件，对测序数据进行STR等位基因命名、iSNP分型和DNAm水平分析，实现了等位基因与甲基化状态的关联分析。样本来源于48名知情同意的志愿者。

STR选择与基于芯片的候选区域表征

研究首先从商业MPS试剂盒中筛选了35个常染色体STR，最终选定22个在其重复区域或侧翼±100 bp范围内包含至少一个CpG位点的STR进行后续研究。通过分析公共甲基化芯片数据（GSE59509），初步发现SE33基因座侧翼的cg10502590位点在精液样本中呈现低甲基化，提示其可能用于精液贡献者识别的潜力。

STR和iSNP等位基因的验证

使用商业控制DNA（2800M, 9947A, 9948, HCT116 DKO）验证STR和iSNP在亚硫酸氢盐转化DNA中等位基因判读的准确性。结果显示，绝大多数（45/46）杂合子基因型能被正确识别，且主要等位基因与长度参考数据一致。但在SE33等位基因长度差异较大时观察到扩增偏好性。iSNP分型在所有样本中均正确。研究表明，对亚硫酸氢盐转化后的DNA进行STR分析总体可行，但需注意杂合子等位基因失衡、stutter峰以及可能丢失的isoallele信息（如D8S1179）。

STR邻近CpG位点的DNA甲基化

研究团队系统评估了18个STR的38个侧翼CpG位点在七种体液中的DNA甲基化水平。根据甲基化模式的差异，将这些位点分为四组：

a) 在精液中显示差异性甲基化的位点：包括FGA(-67, -56)、D5S2800(-50, +21)、SE33(-95, -84, -82, -75, -73, -29)和D8S1179(-45, -1)的侧翼CpG位点。这些位点在精液中的甲基化水平变化较大，部分个体呈现显著低甲基化。

b) 显示组织差异性甲基化的位点：D1S1677+1和D19S433-30在精液中平均甲基化水平最高，在血液中最低，但个体间存在异质性。

c) 甲基化水平较高且体液间差异较小的位点：如TH01-79， D13S317-54等，均值超过75.1%，但不同体液间存在重叠且个体内方差较大。

d) 甲基化水平高且体液间几乎无差异的位点：如D1S1677(-43), TPOX(-39,-36,+17,+42,+68,+77)等，均值>87.7%，方差小。

研究发现，STR邻近的CpG位点单独使用不足以进行体液鉴定，但某些位点（尤其是精液相关位点）在特定混合样本（如含精液）的贡献者分配中具有潜力。值得注意的是，在D8S1179中观察到等位基因关联的甲基化模式，提示重复次数可能与甲基化水平相关。

已知tDMPs与侧翼iSNPs的评估

研究人员评估了8个已发表的tDMP及其邻近iSNP位点。结果证实了这些标记在目标体液（精液：cg20162146, cg24742744；血液：cg06379435, cg24124443；阴道液：cg03874199-212, cg26079753；唾液：cg21189537, cg21597595）中的特异性甲基化模式。同时，也观察到了月经血在某些血液和阴道液特异性标记上的交叉反应，以及颊粘膜在唾液标记上的不同甲基化响应。鼻腔分泌物未与任何测试标记发生交叉反应。

等位基因关联DNAm在示例性体液混合物中的分析

为初步验证贡献者分配可行性，研究分析了一个1:1比例的男精液-男唾液DNA混合样本。通过分析在精液和唾液中显示差异性甲基化、且贡献者基因型不同的位点（如D8S1179-45, FGA-67, cg21189537, cg20162146, cg21597595），成功地将等位基因关联的DNA甲基化水平与特定的体液（精液或唾液）指示性模式相匹配，从而正确地将贡献者p1指派为精液来源，p2指派为唾液来源。这表明STR邻近DNAm和tDMP-iSNP位点是混合斑迹中体液与贡献者关联的有前景的靶标。

结论与展望

本研究成功开发并验证了一种基于亚硫酸氢盐MPS和FDSTools软件的分析流程，能够对转化后的DNA进行STR/iSNP分型和等位基因关联的DNA甲基化分析。研究发现了多个STR侧翼CpG位点具有体液差异性甲基化特征，并证实了已知tDMP-iSNP位点在混合样本贡献者分配中的价值。尽管STR邻近DNAm位点单独用于体液鉴定能力不足，但在已知体液和贡献者STR谱的前提下，对于特定混合情况（如含精液）的贡献者分配显示出潜力。

该研究为法医复杂生物检材的分析提供了新的方法论和思路。未来的研究将侧重于优化FDSTools性能、深入进行混合样本分析、评估低模板和降解DNA样本的适用性，以及探索更多STR系统或生物材料中的DNA甲基化变异。尽管面临亚硫酸氢盐转化导致DNA损伤、复杂STR序列分析等挑战，但本研究提出的整合遗传标记与表观遗传标记的分析策略，为法医DNA分析开辟了新的可能路径。