BMSC来源外泌体递送LncRNA-ZFAS1通过miR-9/IGF-1轴促进成骨细胞增殖分化的机制研究

《Journal of Orthopaedic Surgery and Research》：BMSC-derived exosomal lncRNA-ZFAS1 regulates the proliferation and differentiation of osteoblasts via the miR-9/IGF-1 signaling axis

本研究针对骨质疏松等骨疾病中成骨细胞功能不足的临床难题，探讨了骨髓间充质干细胞（BMSC）来源外泌体（EXOs）中长链非编码RNA ZFAS1的调控机制。研究人员通过实验证实，BMSC-EXOs可高效递送ZFAS1至成骨细胞，通过竞争性结合miR-9解除对IGF-1的抑制，从而促进成骨细胞增殖和分化。该发现为骨代谢疾病治疗提供了新的分子靶点。

　　

骨骼是维持人体结构的关键组织，而成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，在维持骨骼稳态中扮演着重要角色。随着人口老龄化加剧，骨质疏松等骨骼疾病的发病率逐年攀升，这类疾病通常与成骨细胞生成减少和功能减退密切相关。目前临床上迫切需要寻找安全有效的方法来促进成骨细胞的形成和功能。

在骨微环境中，骨髓间充质干细胞（BMSC）与成骨细胞之间存在密切的相互作用。近年来研究发现，BMSC不仅能够分化为成骨前体细胞，还能通过分泌外泌体（Exosomes，EXOs）影响成骨细胞的功能。外泌体是直径20-100纳米的细胞外囊泡，能够携带蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，在细胞间通讯中发挥重要作用。特别值得注意的是，BMSC来源的外泌体（BMSC-EXOs）具有独特的成骨诱导能力，但其具体作用机制尚不完全清楚。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，近年来被证实在多种生物学过程中发挥重要调控作用。其中，ZFAS1是一种在BMSC-EXOs中显著富集的lncRNA，但其在成骨细胞功能调控中的作用尚未明确。为了探索这一科学问题，孙辉等研究人员在《Journal of Orthopaedic Surgery and Research》上发表了最新研究成果，系统阐述了BMSC-EXOs通过递送ZFAS1调控成骨细胞增殖和分化的分子机制。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究。他们从商业来源获得人BMSC和成骨细胞系hFOB 1.19进行细胞培养，通过超速离心法分离提取BMSC-EXOs，并利用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）对EXOs进行形态学和粒径表征。通过蛋白质印迹法（Western blot）检测外泌体标志物CD9、CD63和CD81的表达。运用实时定量PCR（RT-qPCR）技术检测ZFAS1、miR-9和IGF-1的表达水平。通过荧光原位杂交（FISH）和核质分离实验确定ZFAS1的亚细胞定位。采用双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）验证ZFAS1与miR-9、miR-9与IGF-1之间的相互作用。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红（ARS）染色评估成骨细胞增殖和分化情况。

BMSC-EXOs中富含ZFAS1

研究人员首先从人骨髓间充质干细胞中成功分离出外泌体。透射电镜显示BMSC-EXOs呈典型的杯状形态，纳米颗粒跟踪分析表明其粒径主要分布在50-250纳米范围内。蛋白质印迹结果证实这些外泌体表达CD9、CD63和CD81等外泌体标志蛋白。更重要的是，RT-qPCR分析发现ZFAS1在BMSC-EXOs中的表达水平显著高于亲本BMSCs，表明ZFAS1在外泌体中特异性富集。

BMSC来源外泌体将ZFAS1递送至成骨细胞

为了验证BMSC-EXOs能否将ZFAS1递送至成骨细胞，研究人员用PKH26红色荧光染料标记EXOs，并与hFOB 1.19成骨细胞共培养。荧光显微镜观察显示，成骨细胞能够有效摄取标记的EXOs。相应地，RT-qPCR检测发现，经EXOs处理的成骨细胞中ZFAS1表达水平显著高于未处理组。当研究人员在BMSCs中转染荧光标记的ZFAS1探针后，从这些细胞提取的外泌体成功将标记的ZFAS1递送至受体hFOB 1.19细胞中，这直接证实了BMSC来源的外泌体能够将ZFAS1直接传递至成骨细胞。

BMSC来源外泌体ZFAS1促进成骨细胞增殖和分化

为了研究外泌体ZFAS1在调控成骨细胞功能中的作用，研究人员将转染sh-NC或sh-ZFAS1的hFOB 1.19细胞与BMSC-EXOs共培养。RT-qPCR证实ZFAS1敲低成功，而BMSC-EXOs共培养可部分恢复ZFAS1表达。CCK-8实验显示，ZFAS1敲低显著抑制hFOB 1.19细胞增殖，而BMSC-EXOs共培养可部分逆转这种抑制效应。由于碱性磷酸酶表达和矿化结节形成是成骨细胞分化和成熟的标志，研究人员发现BMSC-EXOs可部分恢复因ZFAS1敲低而受损的矿化结节形成，并提高ZFAS1敲低细胞中的ALP活性。此外，ZFAS1敲低显著逆转了BMSC-EXO诱导的ALP、RUNX2、BMP2和ATF4 mRNA水平升高，这些基因已知参与调控成骨细胞分化。这些数据表明，BMSC来源的外泌体ZFAS1能够促进成骨细胞增殖和分化。

ZFAS1靶向并抑制成骨细胞中的miR-9

为了探究ZFAS1调控成骨细胞分化的机制，研究人员通过荧光原位杂交和核质分离实验确定ZFAS1主要位于细胞质中。生物信息学分析预测ZFAS1具有miR-9结合位点。双荧光素酶报告实验证实miR-9与ZFAS1直接结合。RT-qPCR结果显示，BMSC-EXO处理下调miR-9表达水平，而ZFAS1敲低有效逆转了这种外泌体介导的抑制效应，表明ZFAS1靶向并抑制成骨细胞中miR-9的表达。

ZFAS1/miR-9调控成骨细胞增殖和分化

为了阐明ZFAS1/miR-9轴在成骨细胞增殖和分化中的调控作用，研究人员进行了功能回复实验。在ZFAS1敲低细胞中抑制miR-9不会显著改变ZFAS1表达水平，但ZFAS1沉默显著增加了miR-9表达，而这种效应可被miR-9抑制剂逆转。CCK-8实验显示，miR-9抑制增强了成骨细胞增殖，而ZFAS1减少抑制了细胞增殖。茜素红染色和ALP染色结果表明，miR-9抑制促进了成骨细胞分化，而ZFAS1减少抑制了成骨细胞分化。通过RT-qPCR评估ALP、RUNX2、BMP2和ATF4等标志物，进一步证实ZFAS1增加可增强hFOB 1.19的分化。重要的是，shZFAS1对成骨细胞增殖和分化的抑制效应可被miR-9抑制剂逆转，表明ZFAS1通过抑制miR-9调控成骨过程。

ZFAS1竞争性结合miR-9调控IGF-1表达

为了深入研究ZFAS1/miR-9相互作用的下游靶点，研究人员通过生物信息学分析预测miR-9的下游靶蛋白。结果显示miR-9具有IGF-1结合位点。RNA结合蛋白免疫沉淀实验证明miR-9可被抗IGF-1抗体有效富集。为了验证结合位点，研究人员构建了含有野生型IGF-1（包含miR-9靶序列）和结合位点突变体的双荧光素酶报告质粒，将其与miR-9模拟物共转染。实验证实miR-9直接结合IGF-1的3'非翻译区。RT-qPCR和蛋白质印迹分析显示，抑制miR-9可增加IGF-1水平，而抑制ZFAS1降低了IGF-1水平，这种降低可被miR-9抑制剂逆转。这些发现证实ZFAS1通过竞争性结合miR-9正向调控IGF-1表达。

本研究阐明了BMSC-EXOs通过递送LncRNA-ZFAS1调控成骨细胞增殖和分化的分子机制。ZFAS1通过竞争性结合miR-9，解除对IGF-1的抑制，从而促进成骨细胞功能。这一发现不仅揭示了骨微环境中细胞间通讯的新机制，也为骨质疏松等骨相关疾病的治疗提供了潜在靶点。

尽管该研究存在一些局限性，如仅使用细胞模型而未进行动物实验验证，且BMSC-EXOs中含有多种其他物质，它们可能也参与调控过程，但这些发现为基于外泌体的骨疾病治疗策略奠定了重要理论基础。未来研究可进一步探索ZFAS1/miR-9/IGF-1轴影响成骨细胞钙沉积和ALP活性的下游机制，以及在动物模型和临床样本中的验证工作。