综述：中国的人、动物、生鲜农产品和水中的环孢子虫：环孢子虫物种的宿主特异性及C. cayetanensis人畜共患传播的意义

《One Health Advances》：Cyclospora in humans, animals, fresh produce and water in China: implications for host specificity of Cyclospora species and zoonotic transmission of C. cayetanensis

本综述系统梳理了环孢子虫（Cyclospora）在中国人畜和环境中的分子流行病学研究进展。文章重点探讨了人类病原体C. cayetanensis在中国的流行特征、遗传独特性及其人畜共患传播潜力的争议，并指出国内部分研究因方法学局限（如PCR引物交叉反应、错误参考序列）导致了对动物宿主中环孢子虫的误判。作者强调需结合显微镜检和多基因位点序列分析（Multilocus Sequence Typing, MLST）进行准确诊断，这对厘清环孢子虫物种宿主特异性及制定科学的“One Health”防控策略具有重要意义。

　　

环孢子虫（Cyclospora）是一类常见的顶复门（Apicomplexa）原虫寄生虫，主要寄生于人类和一些动物的小肠，引起腹泻和胃肠炎。目前已知有22种环孢子虫，其中C. cayetanensis是导致全球人类环孢子虫病（cyclosporiasis）的病原体。家畜（特别是牛）以及某些野生动物已被确定为环孢子虫的宿主，并且有报道称动物中存在推定的C. cayetanensis感染。这些发现引发了人们对环孢子虫物种宿主特异性以及C. cayetanensis人畜共患传播风险的担忧。

中国人类C. cayetanensis的流行病学

C. cayetanensis在中国呈地方性流行。中国首例人类环孢子虫病病例于1995年报告。此后，在至少七个省份（包括云南、安徽和浙江）发现了人类病例。不同研究中C. cayetanensis的感染率在0.2%到10.0%之间波动。通过PCR检测，中国人类C. cayetanensis的总体感染率为0.8%（111/13,703），低于全球3.4%的水平。现有研究中，河南省的样本量显著大于国内其他同类研究，这种样本量和研究设计的差异可能给全国总体感染率的估计带来偏差。

中国人类环孢子虫病的流行率因居住地、季节以及宿主的临床/免疫状态而异。在上海和镇江的腹泻住院患者中观察到的流行率最低（0.2%, 13/5341）。相比之下，在广西进行的一项小规模研究中报告了最高流行率（10.0%, 5/50），该研究的样本采集自商业猴场的工人和附近村民。安徽省的一项研究揭示了健康人群（0.3%）、腹泻患者（5.6%）和免疫缺陷患者（9.4%）之间，以及城市（0.9%）和农村（3.9%）居民之间C. cayetanensis感染率的显著差异。此外，环孢子虫感染在儿童中尤为普遍。河南的一项研究表明学龄儿童感染率最高。由于环孢子虫卵囊需要在环境中孢子化后才具有传染性，因此感染呈现季节性趋势，在5月至7月感染率较高，这与其它中低收入国家的情况一致。河南的另一项研究发现，该省检测到的81例环孢子虫病中，95%发生在7月至9月的夏季月份。上海的一项为期一年的研究也支持了这一观察结果，该研究中环孢子虫感染主要发生在5月至7月。

中国C. cayetanensis的遗传特征

基因分型工具可用于对C. cayetanensis分离株进行遗传表征。C. cayetanensis的全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）极大地促进了这些工具的开发，为识别多态性序列和开发多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）工具提供了数据。

中国的C. cayetanensis似乎代表了一个独特的种群。对五个微卫星位点（CYC3, CYC13, CYC15, CYC21, CYC22）的MLST分析显示，34个C. cayetanensis分离株具有高遗传多样性，并且中国与非中国分离株之间存在显著差异。随后对来自不同国家的MLST数据进行的群体遗传分析证实了按地理来源划分的分离株存在群体遗传隔离。因此，中国分离株形成了两个亚群，与来自其他国家的分离株形成的亚群不同。每个流行区内寄生虫之间的遗传交换和自然选择很可能导致了按地理来源的分离株群体分化，并形成了C. cayetanensis的整体流行结构。WGS和线粒体基因组数据的系统发育分析证实了中国C. cayetanensis的遗传独特性。

中国动物中的环孢子虫

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  *灵长类动物中的环孢子虫
  已知有五种环孢子虫感染灵长类动物，包括人类致病性的C. cayetanensis和四种感染非人灵长类的物种：C. cercopitheci, C. colobi, C. papionis 和 C. macacae。在中国，已在非人灵长类动物中检测到环孢子虫感染，包括食蟹猴（Macaca fascicularis）、恒河猴（Macaca mulatta）和川金丝猴（Rhinopithecus roxellanae），感染率在0.5%到7.4%之间。

在中国猕猴中鉴定出的主要环孢子虫物种是C. macacae。该物种在恒河猴和食蟹猴中均有发现。此外，有两项研究报道在中国恒河猴中发现了C. cayetanensis。然而，鉴于C. cayetanensis的SSU rRNA基因高度保守，且目前非人灵长类中的四种环孢子虫物种感染不同的旧大陆猴（均属于猴科），在恒河猴中鉴定C. cayetanensis应谨慎对待。此外，中国金丝猴中的环孢子虫可能代表一个新物种。

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  *牛中的环孢子虫
  在中国和日本的牛中报道了一种环孢子虫样寄生虫。最初基于卵囊的球形、小尺寸（约8微米）和抗酸特性，在中国广州的奶犊牛中检测到该寄生虫。孢子化后，卵囊内发现两个孢子囊。从这些犊牛中获得的两条501 bp的SSU rRNA序列（DQ082866和DQ082867）与来自人类和非人灵长类的环孢子虫的系统发育亲缘关系，导致该寄生虫被鉴定为环孢子虫样。在随后的几项研究中，在奶牛和肉牛中检测到了这种寄生虫。

然而，后续研究发现，环孢子虫样寄生虫的序列DQ082866与来自日本E. subspherica的多个序列完全相同。尽管DQ082867与DQ082866有2个碱基的差异，但日本E. subspherica分离株本身的SSU rRNA基因也存在微小差异（2个碱基）。除环孢子虫样寄生虫外，一项研究还在少数奶牛中检测到C. cayetanensis。同样，该研究中的序列似乎包含大量错误，其中一些“C. cayetanensis”序列在系统发育分析中与艾美耳球虫序列聚在一起。另一项研究进一步在山西的几头牛中鉴定出一种C. colobi样寄生虫，但用于C. colobi的参考序列来自废水样本，并且与来自几种野生鸟类的等孢球虫序列相同。

牛中发现的环孢子虫样寄生虫的分类学归属仍有疑问。组织学检查显示该寄生虫位于宿主细胞的核内，这一特征与牛艾美耳球虫相似。一个日本研究组进行了更详细的研究，将日本牛中的核内环孢子虫样寄生虫鉴定为E. subspherica。由于E. subspherica和环孢子虫样寄生虫的卵囊形状和大小相似，这可能导致将E. subspherica误认为环孢子虫样。系统发育分析表明，牛中核内艾美耳球虫与胞浆内艾美耳球虫的系统发育分歧，很可能导致将E. subspherica误认为环孢子虫样。

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  *其他动物中的环孢子虫
  近年来，随着中国社会经济的迅猛发展，宠物、毛皮动物和蛇类养殖业显著增长。一些调查表明，环孢子虫的宿主范围已扩大到不仅包括人类、非人灵长类和牛，还包括伴侣动物（狗和猫）、毛皮动物（狐狸、水貂和貉）、蛇类和其他动物。

有报道称在上海的狗和猫的少量样本中检测到环孢子虫，并且获得的环孢子虫序列与C. cayetanensis的参考序列100%相同。但未进行其他基因位点的PCR或序列分析来确认C. cayetanensis的鉴定。此外，不清楚这些检测是否由狗猫食入人类粪便引起。

中国东北地区的一项近期研究揭示了不同种类毛皮动物和不同地理位置的环孢子虫感染率存在差异。然而，这些动物的总体感染率较低。通过限制性片段长度多态性分析初步诊断环孢子虫。由于物种间序列差异有限，对SSU rRNA PCR产物进行RFLP分析并非鉴定环孢子虫和艾美耳球虫物种的可靠方法。虽然该研究使用了序列分析和系统发育分析来确认环孢子虫的诊断，但这些分析中未包含艾美耳球虫序列。重新分析显示，这些有问题的序列与鸡的E. tenella序列聚在一起。

对中国蒙古瞪羚肠道原生生物的调查显示，C. cayetanensis的总体感染率为30%。这一诊断基于所获得的SSU rRNA序列与包含非人灵长类环孢子虫序列的同一进化支聚类的观察。然而，系统发育分析中未包含艾美耳球虫序列。重新分析表明，这些“C. cayetanensis”序列来自艾美耳球虫属。

蛇在中国和其他一些国家作为宠物被广泛饲养。中国近期的一项研究在六种蛇的812份样本中检测到环孢子虫，感染率为2.7%。然而，重新分析显示，从蛇中获得的“C. cayetanensis”序列均未与来自灵长类的已确定环孢子虫物种聚类。其中七个序列与来自牛的核内E. subspherica密切相关，而其余九个序列形成了一个单独的分支，其中包含来自鸡的E. tenella。因此，在系统发育分析中使用错误的环孢子虫参考序列并排除艾美耳球虫参考序列，很可能导致蛇中C. cayetanensis的误诊。

中国生鲜农产品和水中的环孢子虫

对潜在环孢子虫传播源的流行病学研究表明，感染主要与食用生鲜农产品有关。在中国，仅在河南省有限地区的生菜中检测到C. cayetanensis污染。此外，在几种类型的水体中发现了环孢子虫卵囊，表明水可以作为传播媒介。早期研究显示，在贵州一个猕猴经常沐浴的湖泊采集的水样中，有17.4%检测出C. macacae阳性。近期广州一项大规模水生病原体分子调查，在3个下水道样本和1个污水处理厂样本中检测到C. cayetanensis，总检出率为2.7%（4/150）。

总体讨论与未来展望

环孢子虫和艾美耳球虫是艾美耳科中生物学和遗传学上相关的球虫。对SSU rRNA、质体基因组和线粒体序列的系统发育分析表明，环孢子虫和艾美耳球虫物种根据宿主来源形成簇。因此，灵长类环孢子虫形成一个簇，嵌套在不同动物群体的艾美耳球虫簇之间。环孢子虫在艾美耳球虫内的系统发育位置表明它可能表现出很强的宿主特异性。

然而，最近中国对动物中环孢子虫的研究对环孢子虫物种的宿主特异性和C. cayetanensis的人畜共患潜力提出了挑战。这些环孢子虫的检测大多基于粪便样本的PCR分析以及与参考环孢子虫序列的相似性。由于环孢子虫和艾美耳球虫物种之间的遗传相似性以及它们之间SSU rRNA基因有限的序列差异，几乎所有针对SSU rRNA基因的PCR检测都不可避免地会同时扩增环孢子虫和艾美耳球虫的DNA。在分析来自人类和非人灵长类的样本时，这不是主要问题，因为这些宿主中不存在艾美耳球虫，但在分析其他动物的样本时应谨慎，因为大多数动物经常感染多种艾美耳球虫。在SSU rRNA序列的直接比较和系统发育分析中缺乏参考艾美耳球虫序列，导致了几种动物物种中环孢子虫的误诊。

在一些中国研究中检测到动物体内的C. cayetanensis是出乎意料的。通过对序列数据的重新分析，这一发现已被反驳。使用错误的C. cayetanensis参考序列导致了这种误诊。多个未发表的GenBank序列（可能全部来自E. tenella）被多项研究用作C. cayetanensis的参考序列，这导致了对牛、狐狸、水貂、貉和蛇中C. cayetanensis的误判。这些错误的报告混淆了不同环孢子虫物种的跨物种传播潜力以及C. cayetanensis人畜共患传播的可能性，因此具有重要的公共卫生影响。

为了减少在意外宿主中错误鉴定C. cayetanensis和其他环孢子虫物种，我们建议在分析样本和序列时采用以下程序：

1. 1.
   显微镜检查是诊断环孢子虫病的金标准，应用于确认意外宿主中环孢子虫的鉴定。应测量卵囊的大小和形状指数。环孢子虫卵囊呈球形，大小为8-10微米。每个孢子化的环孢子虫卵囊含有两个孢子囊，每个孢子囊有两个子孢子；而每个孢子化的艾美耳球虫卵囊含有四个孢子囊，每个孢子囊有两个子孢子。使用紫外激发滤光片的 epifluorescence microscopy 可以显著提高显微镜检测的灵敏度。
2. 2.
   在SSU rRNA序列的直接比较和系统发育分析中应使用有效的参考序列。由于流行的诊断性PCR所靶向的部分SSU rRNA序列在灵长类环孢子虫和一些艾美耳球虫之间具有超过98%的相似性，因此直接序列比较不应用作检测和诊断环孢子虫物种的唯一方法。在系统发育分析中包含代表性的艾美耳球虫序列可以减少将艾美耳球虫误认为环孢子虫的情况。
3. 3.
   应使用其他基因位点的二次PCR分析来确认动物样本中C. cayetanensis的检测。这可以包括对已建立的MLST位点进行PCR和序列分析。此外，细胞色素c氧化酶亚基I（Cytochrome c oxidase subunit I, COI）基因可作为鉴定球虫类群的优秀标记。将COI位点与SSU rRNA序列结合作为“锚定点”可能有助于解析环孢子虫内并系关系的分辨率。

结论

虽然一些中国研究关于环孢子虫物种的宿主特异性和C. cayetanensis的人畜共患潜力得出了相互矛盾的结果，但从其他关于人类C. cayetanensis感染的分子流行病学研究中获得了宝贵的数据。这些研究增进了我们对C. cayetanensis传播和遗传多样性的理解，揭示了该病原体在中低收入国家的群体遗传学和进化，并促进了用于调查高收入国家环孢子虫病暴发的基因分型工具的开发。未来的研究需要整合先进的流行病学设计和病原体分型方法，以提高我们对人类和动物中环孢子虫生态学和传播动力学的理解。这些研究的目标应为收集准确数据，为中国乃至全球环孢子虫病的有效控制和预防措施的制定提供依据。