3D4细胞系身份误判：转录组学揭示其呼吸上皮细胞本质及对猪免疫研究的影响

《Veterinary Research》：3D4 cells exhibit transcriptional features inconsistent with alveolar macrophage identity

本研究针对广泛使用的猪肺泡巨噬细胞模型3D4细胞系对LPS刺激无反应的问题，通过TLR配体刺激实验和转录组分析，发现3D4细胞缺乏关键巨噬细胞标志物和模式识别受体表达，反而呈现呼吸上皮细胞特征，为解决细胞系误分类问题提供了重要证据，对猪免疫学研究模型选择具有重要意义。

　　

在免疫学研究领域，细胞模型的选择至关重要，尤其是在畜牧兽医和生物医学研究中。猪作为一种重要的农业经济动物和生物医学模型，其免疫机制研究备受关注。肺泡巨噬细胞作为呼吸道的第一道免疫防线，是许多重要病原体的主要靶细胞，因此建立可靠的猪肺泡巨噬细胞模型对研究呼吸道疾病具有重要意义。

长期以来，3D4细胞系被广泛用作猪肺泡巨噬细胞模型，在各类免疫学实验中频繁出现。然而，研究人员在初步实验中发现了一个令人困惑的现象：3D4/21细胞对脂多糖刺激毫无反应。这一异常情况引发了研究团队的深入思考——这是个别细胞系的特性问题，还是整个3D4细胞系存在更根本的身份认知错误？

为了解开这个谜团，Ma等人开展了一项系统的实验研究。他们首先用多种Toll样受体配体刺激3D4细胞，包括TLR4配体（LPS、超纯LPS、Kdo2-脂质A）和TLR2/TLR1配体（Pam3CSK4），同时以猪外周血单核细胞作为阳性对照。令人惊讶的是，所有刺激物均未能激活3D4细胞的促炎反应，而阳性对照则表现出正常的免疫应答。

这一发现促使研究人员进一步探索3D4细胞的真实身份。他们通过转录组学分析，比较了3D4/21细胞与原代猪肺泡巨噬细胞的基因表达谱。结果显示，两者之间存在10718个差异表达基因，关键肺泡巨噬细胞标志物和谱系决定因子表达缺失，模式识别受体基因表达极低或完全缺失。功能注释分析表明，3D4细胞中高表达的基因富集于上皮细胞特征。

研究人员采用的主要技术方法包括：TLR配体刺激实验、原代猪肺泡巨噬细胞分离（通过肺灌洗从仔猪获得）、全转录组mRNA测序、定量实时PCR验证、人类肺细胞图谱整合分析。这些技术的结合为细胞身份鉴定提供了多层次证据。

3D4/21和3D4/2细胞对TLR4或TLR2/TLR1激活无促炎反应

研究人员用多种TLR配体刺激3D4细胞，发现这些细胞完全缺乏免疫应答能力。与阳性对照相比，3D4细胞中促炎细胞因子IL1B和TNF的表达始终无法检测到，这表明3D4细胞在病原体识别方面存在根本性缺陷。

转录组分析揭示3D4/21细胞与肺泡巨噬细胞之间存在广泛的基因表达差异

转录组比较显示，3D4细胞与原代肺泡巨噬细胞存在巨大差异。关键巨噬细胞标志物如CD163、SPI1（编码PU.1）等表达严重缺失，而PU.1是巨噬细胞分化的关键转录因子。功能富集分析表明，肺泡巨噬细胞中高表达的基因主要与免疫应答相关，而3D4细胞中高表达的基因则与上皮发育相关。

3D4细胞的转录组显示与肺上皮细胞相似

通过人类肺细胞图谱分析，研究人员发现3D4细胞与呼吸上皮细胞具有相似性。3D4细胞表达呼吸上皮干细胞标志物（如EGFR、TP63、KRT5），而缺乏肺泡巨噬细胞的特征性标志物。这种表达模式在3D4/21和3D4/2克隆中高度一致，表明这是3D4细胞系的共同特征。

3D4/21细胞中多种模式识别相关基因表达量低

研究发现3D4细胞中多种模式识别受体表达极低，包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR8等，这解释了为什么这些细胞对TLR刺激无反应。相比之下，TLR3表达较高，这与呼吸上皮细胞的特性一致。

研究结论表明，3D4细胞系被错误地归类为髓系细胞，实际上具有呼吸上皮细胞特征。这一发现对猪免疫学研究具有重要影响，提示研究人员需要重新评估使用3D4细胞作为肺泡巨噬细胞模型的可靠性。同时，研究也展示了组学工具在细胞系鉴定中的重要作用，为未来细胞模型的质量控制提供了重要参考。

该研究的创新之处在于首次系统性地揭示了3D4细胞的真实身份，不仅解释了其异常的免疫应答行为，也为猪呼吸道疾病研究提供了新的视角。虽然3D4细胞不适合作为巨噬细胞模型，但其上皮细胞特性可能使其成为研究呼吸道上皮免疫应答的有价值工具。这一发现强调了细胞系鉴定在实验研究中的重要性，对提高科学研究可重复性具有积极意义。