益生菌株利用龙舌兰及农业副产物碳水化合物生产L/D乳酸的比较研究及其生物技术应用

《Frontiers in Sustainable Food Systems》：Comparative study of L/D lactic acid production in cultures of probiotic strains supplemented with carbohydrates from agave and other agroindustrial resources

本综述系统评估了五种益生菌株（包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等）在不同碳源（单糖、二糖、龙舌兰来源的果寡糖FOS和高分子量菊粉FAPM）下的生长行为及L/D乳酸异构体生产能力。研究揭示了底物特异性对乳酸光学纯度（如鼠李糖乳杆菌在FAPM上L-乳酸比例达96%）和产量的显著影响，通过主成分分析（PCA）明确了生长与产酸的相关性差异。该工作为基于农业副产物（如龙舌兰菊粉）的可持续乳酸生物制造及高值化应用（如生物可降解聚合物PLA）提供了菌株选育与工艺优化的理论依据，契合循环经济战略。

　　

引言

乳酸菌（LAB）作为具有重要工业价值的微生物，在食品和制药领域应用广泛。它们不仅用于生产发酵功能食品，提高生物活性化合物的生物利用度，还通过其抗菌和生物防腐特性贡献于食品的感官和安全属性。乳酸菌天然存在于多种生态环境中，包括发酵食品、口腔和胃肠道，通过维持肠道微生物群平衡促进宿主健康，这些特性使其被广泛用作益生菌。

近年来，农业工业副产物的价值化利用已成为废物管理的一种可持续替代方案。这些副产物富含必需营养素和生物活性化合物，作为开发高附加值产品的底物具有吸引力。其利用不仅代表了一种经济可行的替代方案，也有助于减少废物和循环经济发展的可持续性战略。全球食物浪费量巨大，并贡献了相当比例的温室气体排放，因此急需创新的废物管理策略。

乳酸菌能将乳酸（LA）作为碳水化合物发酵的主要产物。含有乳糖（来自乳制品）、甘油（来自生物柴油）、龙舌兰菊粉以及纤维二糖（来自纤维素水解）的农业工业残留物已显示出作为乳酸生产底物的潜力，这些选择具有双重好处：实现废物价值化和支持可持续生产过程。

乳酸是一种被美国FDA公认安全的有机酸，在多个行业都有应用。在食品领域，它被用作食品防腐剂、安全剂和酸味剂。在化学工业中，它作为pH调节剂、溶剂、清洁剂以及可生物降解聚合物如聚乳酸（PLA）的前体。此外，它在化妆品和制药领域也有应用，包括皮肤护理、控释给药和免疫刺激剂。

乳酸存在两种光学异构体：L-乳酸和D-乳酸。在可生物降解聚合物的背景下，聚乳酸（PLA）的机械性能和可生物降解性显著受这两种对映体比例的影响。具体而言，D/L乳酸比例调节所得聚合物的结晶度、热稳定性和降解速率。因此，大量研究致力于每种异构体的选择性生产和纯化，以满足生物聚合物应用的特殊要求。虽然乳酸的化学合成产生外消旋混合物，但微生物发酵为获得高纯度L-乳酸提供了一种可行的替代方案。然而，野生型LAB菌株，如植物乳杆菌，天然产生外消旋混合物。因此，研究不同菌株和底物产生的乳酸的异构体组成对于优化其工业适用性至关重要。

各种乳酸菌物种，包括嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，已广泛应用于食品生物技术中，用于发酵多种底物，特别是在合生元功能食品的开发中。除了营养应用，这些菌株因其合成生物活性代谢物（包括乳酸异构体、胞外多糖和抗氧化化合物）的能力，在工业和生物医学领域日益受到关注。

除了公认的安全性和益生菌地位外，某些LAB属，如植物乳杆菌属、干酪乳杆菌属和双歧杆菌属，表现出显著的抗氧化特性。这些作用通过产生抗氧化酶、谷胱甘肽和胞外多糖介导，有助于减轻氧化应激和调节细胞信号通路，如Nrf2/NF-κB。这些特性进一步支持它们适用于健康导向的生物技术应用。

为了指导针对特定异构体生产的菌株和条件的合理选择，使用模型底物（包括单糖、二糖和寡糖）能够精确表征LAB的底物偏好和发酵能力。这一策略在设计利用复杂碳源（如木质纤维素水解物或富含非常规糖的农业工业副产物）的工艺时尤其相关。

尽管关于LAB葡萄糖和乳糖代谢的文献广泛，但益生菌株对替代碳源（如鼠李糖、阿拉伯糖、龙舌兰来源的果寡糖（FOS）和高聚合度菊粉（FAMP））的发酵行为仍未得到充分探索。这些糖类在龙舌兰残留物和其他膳食纤维中含量丰富，作为可持续发酵过程中的功能性底物具有巨大潜力。

因此，本研究评估了五种益生菌株在选自农业工业副产物的模型底物上的生长性能和乳酸异构体（L-和D-乳酸）产量。结果旨在支持符合循环经济原则的高效和可持续生物工艺的开发。

方法论

益生菌细菌菌株、生长条件和培养基

评估了五种益生菌株，包括从美国模式培养物集存库（ATCC?）获得的四种乳酸菌物种：干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）ATCC? 334、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）ATCC? 8014、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）ATCC? 53103、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）ATCC? 55730（Limosilactobacillus reuteri）和动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）ENCB-IPN。菌株在2% MRS-葡萄糖肉汤和琼脂中于37±2°C培养24小时，以确认其活力和生长。培养物在4°C下以6000 rpm离心5分钟获得细菌沉淀，用高压灭菌的0.1%蛋白胨水（pH 7.0±0.1）洗涤两次。将沉淀重悬于500μL无菌水中，并使用酶标仪调整至595 nm处初始光密度为0.125（相当于1×10⁶ CFU/mL，对应麦克法兰比浊管0.5）。

碳水化合物底物包括八种单糖——葡萄糖（GLU）、果糖（FRU）、麦芽糖（MAL）、甘油（GLY）、鼠李糖（RHA）、阿拉伯糖（ARA）、甘露糖（MAN）、木糖（XYL）和半乳糖（GAL）；三种二糖——纤维二糖（CEL）、乳糖（LAC）和蔗糖（SUC）；以及一种三糖——棉子糖（RAF），均购自Merck。此外，还包括通过膜分离技术获得的龙舌兰来源的果寡糖（FOS）和高分子量菊粉（FAPM）。

菌株在不同碳水化合物下的生长行为

在修改后的MRS肉汤（包含1% (w/v) 相应碳水化合物作为唯一碳源）中获得了副干酪乳杆菌（L. paracasei）、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和动物双歧杆菌的生长曲线。孵育在96孔板中进行，温度为37±2°C，发酵体积为200μL，使用酶标仪进行内部振荡。

底物同化能力通过记录595 nm处的光密度（OD）来评估，该波长常用于乳酸菌和双歧杆菌物种的浊度生长监测。测量在24小时内每小时进行一次，时间零点对应于新鲜接种指数生长期细胞的培养物。比生长速率（μ）通过绘制OD自然对数与时间的关系图来估算。所有实验进行三次重复。

乳酸产量的测定

孵育后，培养物在4°C下以11,000 rpm离心10分钟以去除细胞。收集上清液并保存在-20°C的1.5 mL Eppendorf管中供后续分析。

L-乳酸和D-乳酸浓度使用BioSystems的特异性试剂盒（L-乳酸，COD 12802；D-乳酸，COD 12801）通过酶法测定。两种测定均基于L-乳酸脱氢酶（L-LDH）或D-乳酸脱氢酶（D-LDH）分别将L-或D-乳酸酶促氧化为丙酮酸，同时伴随NAD⁺还原为NADH，后者在340 nm处进行分光光度法定量。

对于每次测定，240μL试剂A（酶溶液，碱性缓冲液，pH 9.5）和3–15μL样品在37°C孵育，随后与60–200μL试剂B（NAD⁺）混合。反应动力学在340 nm下使用差异双试剂读数模式监测，该模式涉及两次吸光度测量：加入试剂A后的初始读数（A1），以及加入试剂B并孵育后的第二次读数（A2）。这种差异动力学方法校正了背景吸光度，并能够准确量化与乳酸浓度成正比的NADH形成。L-乳酸和D-乳酸的吸光度读数时间点分别设定在72秒和480秒，以及72秒和408秒。

使用多级水标准溶液进行校准。结果以g/L表示，系统配置为检测L-乳酸的线性范围在0.02–3.00 g/L，D-乳酸的线性范围在0.004–0.250 g/L。重复性和总不精密度系数（CV）对于L-乳酸低于3.8%，对于D-乳酸低于1.5%，表明分析性能良好。

统计分析

使用多因子分类设计评估碳水化合物类型（单糖、二糖、三糖和多糖）和益生菌株对乳酸产量的影响。

使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验在95%置信水平（p<0.05）下比较L-和D-乳酸产量。所有统计分析使用Statgraphics Centurion XVI进行。使用XLSTAT进行主成分分析（PCA）以评估动力学生长参数与乳酸产量之间的相关性。

结果

益生菌株在不同碳水化合物下的生长行为

为了说明所测试益生菌株的生长行为，图1展示了副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和动物双歧杆菌在24小时孵育期间，使用各种单糖作为唯一碳源时的生长曲线（以595 nm处的光密度测量）。生长模式因菌株和所提供的单糖类型而异。

GLU、FRU和MAN支持所有菌株的强劲生长，OD₅₉₅值接近1.5–2.0。XYL在大多数菌株中产生中等生长，而GLY、RHA和ARA是效果最差的底物，导致生物量积累显著降低。

在评估二糖上的生长时，SUC和CEL成为大多数菌株最有利的底物。LAC也支持细菌生长，但观察到菌株依赖性差异。动物双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌对LAC的利用效率最高，OD₅₉₅值接近1.5–2.0。

果寡糖（FOS）支持的生长与大多数单糖和二糖相比有限，除了鼠李糖（RHA）、甘油（GLY）和阿拉伯糖（ARA），表明并非所有菌株都能有效发酵这种碳水化合物。观察到的最大光密度约为0.5–0.75，反映了底物利用率的降低。高分子量龙舌兰菊粉（FAPM）也观察到类似的生长模式，其在评估的底物中显示生长极微。这种行为是由于这些分子的结构复杂性所致。FOS和FAPM的这种生长限制先前已有报道，显示其生产率低于葡萄糖。然而，菊粉的一个主要优点是在发酵前不需要预先水解或预处理。

为了确定影响乳酸产量的统计学显著因素，在95%置信水平下进行了双向方差分析（ANOVA）。主效应（细菌菌株和碳水化合物来源）及其交互作用均具有统计学显著性（p<0.05）。

根据均值比较分析，植物乳杆菌和动物双歧杆菌获得了最高的乳酸产量。在底物中，有效性顺序为GLU>FRU>SUC>MAN≈CEL>LAC≈GAL。对于RAF、XYL、FOS、RHA、ARA、FAPM和GLY未检测到显著差异，这些底物表现出最低的乳酸产量。

通过主成分分析（PCA）进一步探索了生长性能、代谢物产量和底物类型之间的多变量关系。图4展示了来自PCA的三个双标图，代表了不同碳水化合物底物下最大光密度（OD₅₉₅）、乳酸产量和比生长速率（μ）之间的关系。主要轴F1和F2代表第一和第二主成分，并指示了解释的方差百分比。蓝点对应不同的细菌-底物组合，而红向量代表变量如比生长速率、倍增时间、最大OD和总乳酸的方向和大小。在图4a中，F1和F2占总方差的89.46%（分别为65.23%和24.23%）。F1主要与比生长速率和倍增时间相关，而F2与乳酸产量和最大OD相关。比生长速率和倍增时间在诸如植物乳杆菌与GAL、干酪乳杆菌与MAN以及动物双歧杆菌与MAN等菌株中呈正相关。相反，最大OD似乎与这些变量负相关，特别是对于在GAL、RHA和GLY上生长的干酪乳杆菌。当干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌使用GLU时，观察到乳酸产量与生长之间存在正相关关系。

在图4b中，对二糖（SUC、CEL、LAC）和RAF的PCA显示，F1和F2分别解释了42.89%和34.41%的方差。在RAF上培养的罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌观察到最高的OD。然而，增加的OD并不总是与更高的乳酸产量相关。类似地，较短的倍增时间并不总是对应于更高的比生长速率。尽管如此，乳酸产量与比生长速率之间存在明显的正相关，表明这些参数同步增加。

对多糖的PCA显示，F1和F2分别解释了总方差的53.28%和28.98%（图4c）。在FOS和FAPM上的细菌生长观察到明显区别，表明底物利用的代谢差异。当使用FOS作为碳源时，更高的乳酸产量与比生长速率和最大OD更密切相关。

图5显示了根据碳底物类型和益生菌株的影响，L-和D-乳酸产量的分布。总体而言，对于每种细菌，在所有底物上的L-/D-乳酸比例未观察到统计学显著差异。然而，某些组合表现出对L-乳酸生产的强烈偏好。值得注意的是，在FAPM上生长的鼠李糖乳杆菌实现了最高的L-乳酸比例，达96%，其次是在纤维二糖上生长的干酪乳杆菌，达92.5%。此外，在葡萄糖上生长的动物双歧杆菌产生90.38%的L-乳酸，干酪乳杆菌发酵乳糖产生79.78%的L-乳酸。相反，最高的D-乳酸比例在以乳糖为底物时观察到，植物乳杆菌达到71.35%，罗伊氏乳杆菌达到55.88%。此外，当利用GLY作为碳源时，干酪乳杆菌产生62%的D-乳酸。

讨论

乳酸菌（LAB）可以通过己糖发酵产生乳酸作为主要代谢物。同型发酵LAB使用糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas途径）将单个己糖分子转化为两个乳酸分子，产生两个ATP分子，同时维持NAD⁺/NADH氧化还原平衡。这可以解释在干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌中观察到的较高乳酸产量。

相比之下，异型发酵LAB如罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌由于缺乏果糖-1,6-二磷酸醛缩酶而利用磷酸戊糖途径。因此，这些菌株每分子葡萄糖不仅产生乳酸，还产生CO₂、ATP以及乙醇或乙酸。在这种情况下，乙酰磷酸转化为乙醇需要氧化两个NADH分子，以维持氧化还原平衡。相反，乙酸的形成允许NAD⁺的再生和额外一个ATP分子的产生。

我们的研究结果表明，乳酸异构体（L型或D型）的生产受细菌菌株和发酵底物类型的影响。某些菌株-底物组合有利于导致高纯度L-乳酸的特定代谢途径，而其他组合则促进D-乳酸的生产。另一方面，一些异型发酵LAB（如罗伊氏乳杆菌）增殖或生长性能低下，可能不仅是因为同化复杂碳水化合物来源的代谢影响，还可能是LAB产生的乳酸酸性特征可能作为生长抑制剂，如在罗伊氏乳杆菌JCM1112菌株中研究的情况。

乳酸是一种重要的生物基平台化合物，根据其旋光性可分为D-乳酸和L-乳酸。从鼠李糖乳杆菌发酵龙舌兰菊粉、干酪乳杆菌利用纤维二糖和乳糖以及动物双歧杆菌利用葡萄糖获得的高比例L-乳酸可能归因于两个关键因素：（1）酶特异性和（2）代谢调节，表明在有利的底物条件下L-乳酸脱氢酶（L-LDH）活性占主导。在这些情况下，D-乳酸脱氢酶（D-LDH）的活性或表达降低，导致几乎排他性地生产L-乳酸。

代谢调节也可能决定同型发酵与异型发酵的主导地位，这取决于底物。在鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和动物双歧杆菌中，同型发酵占主导地位，这意味着大多数丙酮酸被引导向L-乳酸形成，而不是替代产物如乙醇或乙酸。

龙舌兰菊粉是基于果糖的聚合物，必须首先水解成果寡糖（FOS）、游离果糖和葡萄糖才能被微生物利用。鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌拥有能够分解这些聚合物的果糖呋喃糖苷酶或β-果糖苷酶。产生的单糖通过果糖-6-磷酸（F6P）途径进入糖酵解，绕过磷酸戊糖途径的代谢分支，有利于L-乳酸生产。类似地，纤维二糖是一种由两个葡萄糖单元通过β-1,4键连接的二糖，被干酪乳杆菌中的β-葡萄糖苷酶水解，使葡萄糖通过葡萄糖-6-磷酸（G6P）进入糖酵解，并促进快速的L-乳酸形成。

在动物双歧杆菌中，葡萄糖代谢主要遵循双歧杆菌支路，也称为果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶途径，这是双歧杆菌属独有的途径。在此路线中，果糖-6-磷酸被F6PPK裂解为乙酰磷酸和赤藓糖-4-磷酸。乙酰磷酸向乙酸或乳酸的转化取决于NADH可用性和L-LDH活性。在高NADH再生条件下，例如在葡萄糖发酵期间，动物双歧杆菌倾向于生产乳酸而非乙酸，提高了转化效率。

相比之下，罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌在发酵乳糖时似乎表现出更高的D-LDH活性，有利于D-乳酸生产。这种行为可能是由于LDH基因调控或细胞内条件（如NAD⁺/NADH比率和碳通量）的差异所致。这些因素可以将代谢平衡转向D-乳酸合成。

LAB发酵产生的L型和D型乳酸在可生物降解聚乳酸的合成中起着重要作用。生物医学领域在组织再生和修复、生物材料技术应用方面，化妆品领域在皮肤护理和黑色素生成治疗方面，仅举几例，都对这两种异构体有极大兴趣。

总体而言，这些发现突出了益生菌株中乳酸生物合成的代谢复杂性，并强调了菌株-底物选择在引导发酵朝向高纯度L-乳酸方面的重要性。

结论

益生菌的生长行为和乳酸产量深受所用底物类型的影响。葡萄糖、果糖以及二糖如纤维二糖和蔗糖在促进细菌生长和乳酸合成方面最为有效。此外，酶特异性和代谢调节在决定L-/D-乳酸比例方面起着关键作用。值得注意的是，鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和动物双歧杆菌显示出对L-乳酸生产的明显偏好。这些结果通过战略性地选择LAB菌株和碳源，为发酵过程提供了宝贵的见解，不仅对食品生物技术，也对医学领域具有意义。我们的发现确保了后续研究将使用源自食品工业副产物的底物，旨在实现有前景的用途和生物医学应用，从而促进这些资源的利用，这是在循环经济中的重要行动。